kub
Островок  здоровья

----
  
записная книжка врача акушера-гинеколога Маркун Татьяны Андреевны
----
 
 
 
Биосинтез нуклеиновых кислот

Предыдущая: Биосинтез пиримидиновых нуклеотидов

Требования и условия биосинтеза нуклеиновых кислот в бесклеточной системе:

  • Наличие энергии [показать]
  • Наличие специфических ферментов [показать]
  • Наличие белковых факторов, проявляющих каталитические свойства ферментов [показать]


Биосинтез ДНК (общий механизм)

Основываясь на данных биспиральной антипараллельной структуры и химического состава ДНК (см. Химия нуклеиновых кислот), а также на данных о значении "активированной" формы энергии для биосинтеза полимерных молекул, А. Корнберг еще в 1955 г. впервые указал на возможность синтеза энзиматическим путем ДНК в бесклеточной системе в присутствии изолированной из Е. coli ДНК-полимеразы и предшественников дезоксирибонуклеозидтрифосфатов; реакция сводится к синтезу новой молекулы ДНК:

синтез молекулы ДНК

Сущность реакции сводится к присоединению мононуклеотидных единиц к свободному 3'-гидроксильному концу ДНК и образованию новой полинуклеотидной цепи в направлении 5'-> 3'; схематически она может быть представлена в виде:

синтез молекулы ДНК

Реакция требует присутствия одноцепочечной ДНК или в крайнем случае небольших фрагментов полинуклеотидов. Пока еще нет полной ясности о значении предобразованной ДНК в действии ДНК-полимераз. Более вероятно мнение, что ДНК служит матрицей, на которой фермент комплементарно и антипараллельно синтезирует новую цепь ДНК. Это можно представить в виде схемы:

синтез молекулы ДНК

Как видно из схемы, последовательность вновь синтезируемого полинуклеотида отражает первичную структуру, и обе цепи по отношению друг к другу являются антипараллельными.

Следует указать, что ДНК-полимераза I оказалась наиболее активной в тех случаях, когда добавленная в качестве матрицы молекула ДНК была предварительно денатурирована. В этих случаях соблюдалась не только точная последовательность оснований, но и ряд физических свойств исходной ДНК. Напротив, если в опытах in vitro была добавлена нативная двухцепочечная ДНК, то вновь синтезированный полинуклеотид значительно отличался от ДНК и, в частности, не обладал свойственной ДНК биологической активностью.

Были предприняты другие подходы к выяснению механизма полимеразной реакции. В лаборатории Корнберга был открыт фаг (ФХ174), содержащий одноцепочечную кольцевую ДНК; когда эта молекула была использована в качестве матрицы в ДНК-полимеразной реакции, то в этих условиях была получена биологически активная ДНК фага. В этой работе важную роль сыграл другой фермент, названный ДНК-лигазой, обладающий способностью катализировать репарацию ДНК, соединение концов разрывов в молекуле ДНК. Было показано, что в процессе репликации одноцепочечная ДНК фага ФХ174 проходит стадию образования двухцепочечной кольцевой ДНК. Применив ряд остроумных подходов, Корнберг и сотр. в опытах in vitro создали искусственную молекулу фага ФХ174, обладающую способностью поражать (инфицировать) Е. coli, вызывая лизис бактерии. Последовательность событий в этой работе может быть представлена в следующей схеме, где исходную молекулу кольцевой ДНК фага ФХ174 пометим плюсом (+), а вновь синтезируемую молекулу-минусом (-) (рис. 106).

В исследованиях Меселсона и Сталя получила подтверждение гипотеза полуконсервативного механизма синтеза ДНК в клетках, означающего наличие в каждой из двух дочерних молекул одной из родительских цепей ДНК (рис. 107).

Репликация ДНК, как правило, начинается с какой-нибудь одной точки на обеих цепях, и направление роста каждой цепи также идет в одном направлении. Кроме того, как было указано выше, ДНК-полимераза I не реплицирует нативную двухцепочечную ДНК и осуществляет синтез только в одном направлении, а именно в направлении 5'->3'. Была предложена интересная гипотеза, объясняющая репликацию обеих цепей нативной молекулы ДНК. Этот механизм требует наличия трех ферментов: ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы и эндонуклеазы. Репликация начинается с разрыва в одной из двух цепей под действием эндонуклеазы. Затем к этому месту присоединяется ДНК-полимераза и начинается непрерывный синтез нового олигонуклеотида на одной из двух родительских цепей в направлении 5'->3', обратный направлению исходной цепи ДНК. Из второй цепи родительской ДНК идет синтез прерывистый, сопровождающийся образованием фрагментов ДНК, также в направлении 5'->3' с последующим объединением фрагментов ДНК при участии ДНК-лигаз в единую полинуклеотидную молекулу. Подобный механизм челночного синтеза ДНК легко объясняет фактические данные накопления коротких фрагментов ДНК у Е. coli во время репликации ДНК.

Совсем недавно было показано, что инициация биосинтеза дочерних цепей ДНК требует предварительного синтеза на материнской ДНК необычного затравочного олигорибонуклеотида, названного праймером, со свободной гидроксильной группой, у 3'-углеродного атома рибозы. Этот олигорибонуклеотид, содержащий около 50 нуклеотидных остатков, синтезируется комплементарно на матрице ДНК при участии особого фермента - РНК-полимеразы (см. ниже). Предполагается, что именно с этой точки концевого 3'-гидроксила рибозы праймера начинается истинный синтез дочерней цепи ДНК, комплементарной родительской. В дальнейшем этот фрагмент РНК, ковалентно присоединенный к новообразованной цепи ДНК, разрушается под действием нуклеаз и возникшая брешь застраивается олигодезоксирибонуклеотидом при помощи той же ДНК-полимеразы. Вполне допустимо предположение, что синтез праймера изолигорибонуклеотида имеет биологический смысл, поскольку в этом случае могут устраняться ошибки, неизбежно возникающие при инициации репликации ДНК.

Этапы биосинтеза ДНК. Предложен ряд моделей механизма биосинтеза ДНК с участием указанных выше ферментов и белковых факторов, однако детали некоторых этапов этого синтеза еще не выяснены. Предполагается, что условно механизм синтеза может быть подразделен на три этапа: инициацию, т. е. сигнализацию, элонгацию, т. е. продолжение, и терминацию, т. е. завершение (прекращение) синтеза.

  1. Первый этап - инициация биосинтеза ДНК - является началом синтеза дочерних нуклеотидных цепей на материнских и сводится, как указано выше, к биосинтезу на материнской ДНК необычного затравочного олигорибонуклеотида (праймера) со свободной гидроксильной группой у 3'-углеродного атома рибозы. Олигорибонуклеотид синтезируется при участии особого фермента - РНК-полимеразы. При инициации к ДНК последовательно присоединяются ДНК-связывающий и ДНК-раскручивающий белок, а затем комплексы ДНК-полимераз и ДНК-зависимая РНК-полимераза (последняя обеспечивает синтез праймера) и ряд других белковых факторов.
  2. Второй этап, получивший название элонгации синтеза ДНК, включает стадию репликации участников материнских цепей ДНК и стадию связывания друг с другом фрагментов новообразуемых цепей ДНК. Первая стадия осуществляется при помощи ДНК-полимеразы, причем синтез идет не непрерывно, а фрагментарно. Японский биохимик Оказаки как будто получил доказательства челночного механизма синтеза ДНК; фермент может вести синтез только в одном направлении 5'->3' сначала на одной цепи материнской ДНК, а затем в том же направлении 5'-->3', но передвигаясь в обратную сторону по другой цепи ДНК. В дальнейшем оказалось, что фрагменты всякий раз синтезируются раздельно, начиная с праймера, который может переноситься с готового фрагмента при помощи одного из белковых факторов репликации в точку старта биосинтеза последующего фрагмента, направленных противоположно по биспиральной молекуле ДНК. Стадия завершается отделением олигорибонуклеотидных праймеров, объединением отдельных фрагментов ДНК при помощи ДНК-лигаз и формированием дочерней цепи ДНК.
  3. Терминация синтеза ДНК наступает скорее всего вследствие исчерпания ДНК-матрицы и обрыва трансферазной реакции. Точность репликации ДНК чрезвычайно высока: может быть одна ошибка на 1010 трансферазных реакций, однако подобная ошибка обычно легко исправляется за счет процессов репарации.

Синтез ДНК на матрице РНК. Выдающимся достижением биохимии нуклеиновых кислот является открытие сначала в составе онковирусов (Раушера и саркомы Рауса) фермента обратной транскриптазы, или ревертазы (или РНК-зависимая ДНК-полимераза), катализирующего биосинтез молекулы ДНК на матрице РНК. Д. Балтимор и Г. Темин, впервые обнаружившие этот фермент, были удостоены Нобелевской премии в 1974 г.

Накоплены данные, показывающие, что многие РНК-содержащие онкогенные вирусы (получившие наименование онкорнавирусов) содержат ревертазу в составе покровных белков. Фермент открыт также во многих клетках прокариотов и эукариотов, в частности в лейкозных клетках, в пролиферирующих тканях, включая эмбриональные ткани. Известно, что ревертаза онкорнавирусов содержит Zn2+ и активируется катионами Мn2+ и Mg2+. Предполагается, что механизм синтеза ДНК на матрице РНК включает три стадии.

На первом этапе фермент ревертаза синтезирует на матрице вирусной РНК комплементарную цепь ДНК, что приводит к формированию гибридной молекулы РНК~ДНК. На втором этапе имеет место разрушение исходной вирусной РНК из комплекса гибридной молекулы под действием РНК-азы. Наконец, на третьем этапе на матрице оставшейся цепи ДНК комплементарно синтезируются новые цепи ДНК. Укажем также, что ревертазной активностью обладают и ДНК-полимеразы. В частности, фермент из Е. coli обладает способностью катализировать синтез ДНК на матрице рРНК.

Значение открытия обратной транскриптазы огромно. Оно имеет существенное значение не только для выяснения закономерностей процесса малигнизации, но и для всей науки о живом, поскольку указывает на возможность передачи наследственной информации от РНК на ДНК, не подчиняясь основному постулату центральной догмы (поток информации идет только в одном направлении: ДНК --> РНК --> Белок

В настоящее время мы вправе дополнить основную схему передачи генетической информации в живой клетке ДНК--> РНК-->белок и представить ее в более полной форме:

На схеме стрелки вокруг ДНК и РНК указывают на возможность копирования себя в живых системах при участии соответствующих ферментов. Как знать, не станем ли мы свидетелями поворота стрелки и на следующей стадии центральной догмы - от белка на РНК, что в принципе могло бы существовать на земле при зарождении первичных живых существ. Исследования обратной транскрипции при участии ревертазы проводятся в широких масштабах в области генной инженерии.


Биосинтез РНК

Современным представлениям о механизме синтеза РНК в клетках мы в значительной степени обязаны открытию в 1960 г. в двух лабораториях США (Гурвич и Вейс) особого фермента - РНК-полимеразы, катализирующего синтез рибонуклеиновой кислоты из свободных нуклеозидтрифосфатов. Фермент требует наличия ионов Mg2+ или Мn2+ и одновременного присутствия всех четырех типов рибонуклеозидтрифосфатов. Самым удивительным свойством фермента оказался факт, что включение нуклеотидов в РНК требовало обязательного присутствия предобразованной ДНК. Позже были открыты также ферменты (преимущественно в составе оболочек фагов и у ряда бактерий), катализирующие синтез РНК на матрица РНК (см. ниже).

При тщательном изучении механизма синтеза РНК при участии РНК-полимераз, обозначаемой также ДНК-зависимая РНК-полимераза (или транскриптаза), было установлено, что молекула предобразованной ДНК необходима не только для реакции полимеризации, но что она всецело определяет последовательность рибонуклеотидов во вновь синтезированной молекуле РНК. Другими словами, на матрице ДНК комплементарно строится полирибонуклеотид, являющийся копией первичной структуры ДНК, с той только разницей, что против тимидилового нуклеотида ДНК в РНК включается уридиловый нуклеотид. Реакция синтеза РНК в общем виде может быть представлена:

В синтезированной молекуле РНК отдельные мононуклеотиды, как и в ДНК, связаны между собой 3'-5'-фосфодиэфирными мостиками. Как можно видеть из этой схемы, механизм действия РНК-полимераз во многом совпадает с таковым у ДНК-полимераз. Синтез также идет в направлении 5'-->3'. Цепь РНК имеет противоположную полярность цепи предобраэованной ДНК. Однако имеются и существенные различия. РНК-полимераза Е. coli предпочтительнее функционирует в присутствии нативной двухцепочечной ДНК и, что самое интересное, в опытах in vitro обе цепи ДНК копируются РНК-полимеразой; in vivo транскрибируется, вероятнее всего, только одна цепь ДНК. Предполагается, что РНК-полимераза связывается с одной цепью нативной ДНК в определенной точке, вызывая расплетение биспиральной структуры на ограниченном участке, где и происходит синтез РНК. Фермент как будто бы не нуждается в присутствии праймера, как ДНК-полимераза. Накопленные данные свидетельствуют о том, что у Е. coli скорее всего имеется единственная ДНК-зависимая РНК-полимераза, которая синтезирует все типы клеточных РНК.

Имеются доказательства синтеза РНК-предшественников (например, 45S РНК, считающаяся предшественником рРНК или про-мРНК; последняя является предшественником матричной мРНК), которые подвергаются постсинтетическим превращениям (процессингу), включающим не только гидролиз и отщепление неинформативной или, точнее, регуляторной части предшественника, но и различные химические модификации (аденилирование, метилирование и др.) оставшейся информативной части РНК.

РНК-полимераза Е. coli изучена наиболее подробно. Это олигомерный фермент, состоящий из двух α- и по одной β1, β2- и σ-субъединице, с общей молекулярной массой около 500 000. Считается, что σ-субъединица, называемая σ-фактором, обладает функцией узнавания некоего участка на матрице ДНК, названного промотором, куда присоединяется РНК-полимераза. Другим субъединицам фермента приписывают функции инициации биосинтеза РНК (α-), связывания субстратов и элонгации синтеза (β-субъединицы).

Следует указать также на открытие ряда белков, принимающих участие в механизме синтеза РНК в клетке, в частности исследуется природа репрессорных белков и белка-терминатора (ρ-фактора). Последний обладает способностью обратимо связываться с терминирующим участком ДНК, включая действие РНК-полимеразы. В отсутствие этого белка образуются исключительно длинные цепи ДНК.

Менее полно изучены РНК-полимеразы эукариотов. Из клеток животных выделены три группы РНК-полимераз: А, В и С, принимающие участие в синтезе соответственно рРНК, мРНК и тРНК.

Современные представления о механизме и регуляции синтеза РНК предусматривают роль, помимо указанного выше участка ДНК промотора, также участка оператора, обратимо связывающегося с белком-репрессором, участком цистрона и терминатора, а также низкомолекулярных веществ. Ведущая роль в дерепрессии оператора придается гормонам.

Синтез РНК при участии ДНК-зависимой РНК-полимеразы специфически тормозится также антибиотиком актиномицином D, который обладает способностью связываться водородными связями с ДНК по месту остатков гуанина. Актиномицин тормозит синтез РНК и в интактных клетках. Он нашел широкое примейение при определении процессов, зависящих от транскрипции ДНК.

Синтез РНК на матрице РНК

Следует указать, что ДНК-зависимая РНК-полимераза может осуществлять транскрипцию ДНК нормальных клеток и ДНК-вирусов. Как же осуществляется синтез РНК у тех вирусов, которые в геноме вместо ДНК содержат РНК? Оказывается, в этих случаях вирусная РНК индуцирует образование в клетках хозяина (например, у Е. coli) РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая участвует в репликации вирусной РНК (отсюда второе название фермента - РНК-репликаза). Фермент также использует нуклеозидтрифосфаты для синтеза одноцепочечной вирусной РНК. Этот синтез должен пройти через стадию образования репликативной формы. Следовательно, в первой стадии РНК-репликаза на матрице РНК-вируса специфически строит комплементарную с противоположной полярностью цепь РНК. Последняя во второй стадии служит матрицей для синтеза РНК, совершенно однотипной исходной вирусной РНК, хотя обе стадии катализируются одним и тем же ферментом; в каждой из них действуют различные белковые факторы.

Следует особо подчеркнуть, что, поскольку РНК-репликаза имеет отношение только к вирусам, очевидно, на этом основании могут быть разработаны эффективные антивирусные лекарственные препараты.

Синтез РНК из нуклеозиддифосфатов. Выше было указано об открытии М. Грюнберг-Монаго и С. Очоа в 1955 г. в клетках E. coli особого фермента - полинуклеотидфосфорилазы, наделенной не только РНК-азной активностью, но и способностью синтеза полимерной молекулы РНК. Фермент требует наличия однотипных или разных рибонуклеозиддифосфатов. Рибонуклеозидтрифосфаты и дезоксирибонуклеозиддифосфаты не оказались субстратами фермента. Хотя фермент не нуждается в матрице, все же для синтеза требуется затравочная цепь РНК со свободной 3'-гидроксильной группой, к которой присоединяются остатки мононуклеотидов. Образовавшаяся полимерная молекула РНК не имеет заданной специфической последовательности мононуклеотидов, но содержит 3'->-5'-фосфодиэфирные связи, легко разрываемые рибонуклеазой.

Относительно биологической роли этого фермента у бактерий имеющиеся данные свидетельствуют, вероятнее всего, о его катаболическом фосфоролизе мРНК, характеризующемся коротким периодом жизни. Подтверждением этого положения являются данные по физиологической концентрации фосфата в клетках.

Следует указать, что полученные в последние годы в лаборатории С. С. Дебова данные свидетельствуют прежде всего о более широком распространении полирибонуклеотидфосфорилазы в живых организмах, чем это признавалось ранее. Фермент открыт также в клетках животных. Кроме того, получены экспериментальные доказательства синтетической функции полинуклеотидфосфорилазы. Вполне правомерно допущение, что этот фермент может принимать участие в синтезе коротких полирибонуклеотидов в клетках эукариотов в норме и при некоторых экстремальных условиях. О значении фермента в образовании синтетических мРНК, сыгравших огромную роль в расшифровке триплетного нуклеотидного кода, было указано выше.


Основные направления современной генной инженерии

В заключение обсудим вкратце основные направления современной генной инженерии. Как известно, конечной целью генной инженерии является получение организмов (животных и растений) с новыми наследственными свойствами c помощью чисто лабораторных приемов. Для достижения этой пока еще отдаленной цели необходимо ввести в организм соответствующий ген или гены (такого рода операция получила наименование трансгеноза). Ген, как было указано выше, представленный определенным участком ДНК и соответствующий определенному белку, можно или выделить из другого организма или синтезировать химическим или биологическим путем. Впервые в 1969 г. из Е. coli был выделен участок ДНК с геном, ответственным за синтез фермента, катализирующего усвоение молочного сахара (лактозы), - так называемый лактозный оперон. Но таких примеров немного. Химический синтез генов аланиновой тРНК впервые осуществил выдающийся индийский ученый - Хар Гобинд Хорана. Состоящий из 77 нуклеотидов, этот ген, однако, in vitro был лишен функциональной активности. Были получены сведения, что тРНК на гене синтезируется в клетках не в готовом виде, а в форме предшественников. Эти данные послужили для Хорана основой синтеза предшественника гена тирозиновой тРНК (из 126 нуклеотидов), хотя сама тирозиновая тРНК состоит из 85 нуклеотидов. Ввиду громоздкости, а также недостаточной эффективности химического синтеза в последние годы все большее место занимают биологические методы синтеза генов при помощи обратной транскриптазы (ревертазы). Для этого необходимо иметь в руках мРНК, с помощью которой можно воспроизвести соответствующий ген. С 1972 г. этим путем синтезированы ДНК-копии на мРНК кодирующие синтез белка глобина (человека, кролика, мыши, голубя, утки), иммуноглобулина и белка хрусталика глаза. Однако на этом пути синтеза генов встречаются большие трудности, связанные с выделением из огромного разнообразия клеточных мРНК нужного для синтеза гена.

Второй этап генной инженерии - перенос генов в клетку (трансгеноз)-осуществляется тремя путями: трансформацией (перенос генов посредством выделенного из клеток и освобожденного от примесей ДНК), трансдукцией (перенос генов посредством вирусов), гибридизацией клеток, полученных из разных организмов (высших животных, микроорганизмов и др.) (рис. 108, 109).

Заключительный этап генной инженерии сводится к адаптации введенного гена в организме хозяина и почти не зависит от искусства экспериментатора.

Таким образом, исследования в области генной инженерии могут служить основой для решения ряда практических задач здравоохранения и сельского хозяйства. В частности, полученные в лаборатории гены, помимо широкого использования в микробиологической промышленности для приготовления лекарственных препаратов белковой природы - гормонов, ферментов и др., будут применяться в качестве лечебных препаратов при лечении многих наследственных заболеваний (их насчитывается более 2000), генетический дефект которых известен только у небольшого числа (не более 50) болезней. Первые попытки применения лактозного оперона при галактоземии (наследственном заболевании, связанном с непереносимостью галактозы из-за отсутствия фермента галактозо-1-фосфат-уридилилтрансферазы) вселяют надежду на реальные практические возможности генной инженерии, хотя вполне обоснованны тревога и опасения, связанные с вмешательством человека в сферу тончайших биологических процессов целостного организма.

Продолжение: Распад нуклеиновых кислот




 
 

Куда пойти учиться



 

Виртуальные консультации

На нашем форуме вы можете задать вопросы о проблемах своего здоровья, получить поддержку и бесплатную профессиональную рекомендацию специалиста, найти новых знакомых и поговорить на волнующие вас темы. Это позволит вам сделать собственный выбор на основании полученных фактов.

Медицинский форум КОМПАС ЗДОРОВЬЯ

Обратите внимание! Диагностика и лечение виртуально не проводятся! Обсуждаются только возможные пути сохранения вашего здоровья.

Подробнее см. Правила форума  

Последние сообщения



Реальные консультации


Реальный консультативный прием ограничен.

Ранее обращавшиеся пациенты могут найти меня по известным им реквизитам.

Заметки на полях


навязывание услуг компании Билайн, воровство компании Билайн

Нажми на картинку -
узнай подробности!

Новости сайта

Ссылки на внешние страницы

20.05.12

Уважаемые пользователи!

Просьба сообщать о неработающих ссылках на внешние страницы, включая ссылки, не выводящие прямо на нужный материал, запрашивающие оплату, требующие личные данные и т.д. Для оперативности вы можете сделать это через форму отзыва, размещенную на каждой странице.
Ссылки будут заменены на рабочие или удалены.

Тема от 05.09.08 актуальна!

Остался неоцифрованным 3-й том МКБ. Желающие оказать помощь могут заявить об этом на нашем форуме

05.09.08
В настоящее время на сайте готовится полная HTML-версия МКБ-10 - Международной классификации болезней, 10-я редакция.

Желающие принять участие могут заявить об этом на нашем форуме

25.04.08
Уведомления об изменениях на сайте можно получить через раздел форума "Компас здоровья" - Библиотека сайта "Островок здоровья"

Островок здоровья

 
----
Чтобы сообщить об ошибке на данной странице, выделите текст мышью и нажмите Ctrl+Enter.
Выделенный текст будет отправлен редактору сайта.
----
 
Информация, представленная на данном сайте, предназначена исключительно для образовательных и научных целей,
не должна использоваться для самостоятельной диагностики и лечения, и не может служить заменой очной консультации врача.
Администрация сайта не несёт ответственности за результаты, полученные в ходе самолечения с использованием справочного материала сайта
Перепечатка материалов сайта разрешается при условии размещения активной ссылки на оригинальный материал.
© 2008 blizzard. Все права защищены и охраняются законом.



 
----