Предыдущая: Биосинтез пуриновых нуклеотидов

Механизм синтеза пиримидиновых нуклеотидов почти полностью расшифрован благодаря исследованиям Рейхарда. Показано, что в клетках животных и микроорганизмов промежуточными продуктами синтеза также не являются свободные пиримидиновые основания и что остаток рибозы присоединяется к уже сформировавшемуся пиримидиновому кольцу. Хотя синтез пиримидиновых нуклеотидов начинается с элементарных уровней (СО₂, NH₃, аспартата и др.), специфическую роль в этом синтезе играет оротовая кислота.

Оказалось, что оротовая кислота, впервые открытая в коровьем молоке, выполняет ключевую роль в синтезе, являясь непосредственным предшественником всех пиримидиновых нуклеотидов. Меченная ¹⁴С и ¹⁵N оротовая кислота открывалась в пиримидиновых основаниях ДНК и РНК тканей животных в опытах in vitro и in vivo. Экспериментами показaно образование оротовой кислоты в срезах печени крыс.

Последовательность химических реакций синтеза пиримидиновых нуклеотидов, в частности уридиловой кислоты, можно представить следующими уравнениями реакций:

Как видно из этих уравнений, первая стадия синтеза уридиловой кислоты включает образование карбамоилфосфата, механизм которого рассмотрен выше (см. Биосинтез мочевины). В клетках печени донатором NH₂-группы являются глутамин и свободный аммиак (NH₃), в то время как во всех остальных клетках организма в синтезе карбамоилфосфата используется только глутамин. Укажем также, что карбамоилфосфатсинтетаза требует для проявления своей активности присутствия N-ацетилглутамата в качестве аллостерического эффектора.

Во второй стадии карбамоилфосфат обратимо реагирует с аспарагиновой кислотой, причем равновесие реакции смещено в сторону синтеза карбамоиласпартата. Последний подвергается циклизации (под действием дигидрооротазы) с отщеплением молекулы Н₂0 и образуется дигидрооротовая кислота, которая, подвергаясь дегидрированию, превращается в оротовую. В этой реакции участвует специфический НАД-содержащий фермент дигидрооротатдегидрогеназа. Оротовая кислота обратимо реагирует с ФРПФ, являющимся донатором рибозо-5-фосфата, с образованием оротидин-5-фосфата (ОМФ). Декарбоксилирование последнего приводит к образованию первого пиримидинового нуклеотида - уридин-5-фосфата (УМФ), т. е. уридиловой кислоты.

Превращение УМФ в УДФ и УТФ осуществляется, как и в случае пуриновых нуклеотидов, путем фосфорилирования:

УМФ + АТФ <--> УДФ + АДФ
УДФ + АТФ <--> УТФ + АДФ

Биосинтез цитидиловых нуклеотидов. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что предшественником цитидиловых нуклеотидов является уридиловая кислота, точнее УТФ, который превращается в ЦТФ. Из последнего образуются другие цитидиловые нуклеотиды:

У прокариотов используется преимущественно свободный аммиак, в то время как в клетках животных ЦТФ-синтетаза катализирует включение амидной группы глутамина в 4-м положении пиримидинового кольца УТФ. Синтез ЦДФ и ЦМФ осуществляется при участии адениловых нуклеотидов путем фосфорилирования.

Биосинтез тимидиловых нуклеотидов. Поскольку тимидиловые нуклеотиды входят в состав ДНК, содержащей дезоксирибозу, рассмотрим сначала механизмы синтеза дезоксирибонуклеотидов. При помощи метода меченых атомов было показано, что этот синтез начинается не со свободной дезоксирибозы, а путем прямого восстановления рибонуклеотидов у 2-го атома углерода. При инкубации меченых предшественников (рибонуклеотидов) в бесклеточной системе бактерий метку обнаруживали в составе дезоксирибонуклеотидов. По данным Рейхарда, у Е. coli все четыре рибонуклеозиддифосфата восстанавливаются в соответствующие дезоксианалоги: dАДФ, dГДФ, dЦДФ, dУДФ при участии сложной ферментной системы, состоящей по меньшей мере из четырех разных ферментов.

Химический смысл превращения рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды сводится к элементарному акту - восстановлению рибозы в 2-дезоксирибозу, требующего наличия двух атомов водорода; непосредственным источником водородных ионов оказался восстановленный термостабильный белок - тиоредоксин (содержит две свободные SH-группы на 108 аминокислотных остатков). Тиоредоксин легко окисляется, превращаясь в дисульфидную S-S-форму; для его восстановления в системе имеется специфический ФАД-содержащий фермент тиоредоксин-редуктаза (молекулярная масса 68 000), требующая наличия восстановленного НАДФН₂. Обозначив условно рибонуклеозиддифосфат символом ХДФ, образование дезоксирибонуклеотидов можно представить следующими двумя уравнениями реакции:

Первая реакция требует затраты энергии. Схематически обе стадии могут быть представлены в следующем виде:

Для синтеза тимидиловых нуклеотидов, помимо дезоксирибозы, требуется также метилированное производное урацила - тимин. Оказалось, что в клетках имеется особый фермент тимидилатсинтаза, катализирующая метилирование не свободного урацила, а dУМФ; реакция протекает по уравнению:

Видно, что донатором метильной группы в тимидилатсинтазной реакции является N₅, N₁₀-метилентетрагидрофолиевая кислота, которая одновременно отдает и водородный протон, поэтому конечным продуктом кофермента является не тетрагидро-, а дигидрофолиевая кислота (ДГФ). Из образовавшегося ТМФ путем фосфотрансферазных реакций образуются dTДФ и dТТФ.

Синтез всех остальных дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов, непосредственно участвующих в синтезе ДНК (см. ниже), также осуществляется путем фосфорилирования дезоксирибонуклеозид-5'-дифосфатов в присутствии АТФ:

АТФ + dАДФ --> АДФ + dАТФ;   АТФ + dЦДФ --> АДФ + dЦTФ;
АТФ + dГДФ --> АДФ + dГТФ;   АТФ + dТДФ --> АДФ + dТТФ.

Таким образом, выше рассмотрены главные механизмы синтеза предшественников ДНК и РНК. Указано на существенность ряда ключевых субстратов (например, оротовой кислоты, аспартата, глутамина и др.) для действия специфических ферментов синтеза нуклеотидов. Ниже в двух схемах суммированы имеющиеся данные о взаимопревращениях пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, а также о связи их с синтезом нуклеиновых кислот. Как видно из представленных данных, в образовании пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов специфическое участие принимает 5-фосфорибозил-I-пирофосфат, являющийся донатором фосфорибозильного остатка в биосинтезе как оротидиловой кислоты, так и инозиновой кислоты; последние являются ключевыми субстратами синтеза нуклеиновых кислот в клетках.

Зная природу непосредственных предшественников нуклеиновых кислот, можно перейти к рассмотрению современных представлений о механизме синтеза нуклеиновых кислот.

Продолжение: Биосинтез нуклеиновых кислот