Предыдущая: Синтез белка

Система синтеза белка, точнее система трансляции, которая использует генетическую информацию, транскрибированную в РНК, для синтеза полипетидной цепи с определенной первичной структурой, включает около 200 типов макромолекул - белков и нуклеиновых кислот. Среди них около 100 макромолекул, участвующих в активировании аминокислот и их переносе на рибосомы (все тРНК, аминоацил-тРНК-синтетазы), более 60 макромолекул, входящих в состав 70S или 80S рибосом, и около 10 макромолекул (называемых белковыми факторами), принимающих непосредственное участие в системе трансляции.

При помощи изотопного метода было выяснено, что синтез белка начинается с N-конца и завершается С-концом, т. е. процесс имеет направление: NH₂-->СООН. Не разбирая подробно природу других весьма важных для синтеза факторов, рассмотрим подробно механизм индивидуальных путей синтеза белковой молекулы в искусственной синтезирующей системе.

Весь белковый синтез, или процесс трансляции, может быть условно разделен на два этапа: активирование аминокислот и собственный процесс трансляции.

Активирование аминокислот

Необходимым условием синтеза белка, который в конечном счете сводится к полимеризации аминокислот, является наличие в системе не свободных, а так называемых активированных аминокислот, располагающих своим внутренним запасом энергии. Активация свободных аминокислот осуществляется при помощи специфических ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз в присутствии АТФ. Этот процесс протекает в две стадии:

Обе стадии катализируются одним и тем же ферментом. В первой стадии аминокислота реагирует с АТФ, и образуется промежуточный продукт, который реагирует с соответствующей 3'-ОН-тРНК, в результате чего образуется аминоацил-тРНК (сокращенно в дальнейшем будет обозначаться аа-тРНК) и освобождаются пирофосфат и АМФ. Аминоацил-тРНК располагает необходимым запасом энергии; она имеет следующее строение:

Необходимо подчеркнуть, что аминокислота присоединяется к концевому 3'-ОН-гидроксилу адениловой кислоты, которая вместе с двумя остатками цитидиловой кислоты образует концевой триплет (ЦЦА), являющийся одинаковым для всех транспортных РНК. Учитывая эти обстоятельства, в дальнейшем специфичность первичной структуры строящейся полипептидной цепи определяется природой антикодона тРНК, а не химической природой аминокислоты.

Вторую стадию матричного синтеза белка-трансляцию, протекающую в рибосоме, условно делят на три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию.

Инициация трансляции

Стадия инициации, являющаяся "точкой отсчета" синтеза белка, требует соблюдения ряда условий, в частности наличия в системе, помимо 70S или 80S рибосом, инициаторной амино-ацил-тРНК, инициирующих кодонов в составе мРНК и белковых факторов инициации. Имеются экспериментальные доказательства, что у бактерий, в частности у Е. coli, инициаторной аа-тРНК является формил-метионил-тРНК, в образовании которой специфическое участие принимают фермент, соответствующая тРНК, обозначаемая тРНК^фмет, метионил-аденилат и N¹⁰-формил-тетрагидрофолиевая кислота (N¹⁰-CHO-TГФ).

Таким образом, N-формил-метионил-тРНК является первой аа-тРНК, которая определяет включение N-концевого остатка аминокислоты и тем самым начало трансляции. Укажем также, что процесс формилирования имеет важный биологический смысл, защищая NH₂-группу аминокислоты и обеспечивая синтез в направлении NH₂->СООН. Помимо тРНК^фмет, у Е. coli имеется обычная тРНК, акцептирующая свободный, а не формилированный метионин. Она обозначается тРНК^мет и обеспечивает перенос метионина в процессе сборки полипептидной цепи. У эукариотов тРНК, специфичной для начального метионина, не подвергающегося формилированию из-за отсутствия соответствующего фермента, является тРНК^мет, которая по своей структуре отличается от обычной тРНК^мет, обеспечивающей перенос остатка метионина в процессе элонгации полипептидной цепи.

Необходимым условием инициации является также наличие инициирующих кодонов, кодирующих формил-метионин. У бактерий эту функцию выполняют триплеты АУГ и ГУГ мРНК. Однако эти триплеты кодируют формил-метионин (или начальный метионин), только будучи начальными триплетами, при считывании матричной мРНК. Если же эти триплеты являются обычными, т. е. внутренними, то каждый из них кодирует свою аминокислоту, в частности АУГ-метионин и ГУГ-валин.

К настоящему времени выяснена природа белковых факторов инициации. У Е. coli открыто три таких инициирующих фактора, обозначаемых соответственно IF₁, IF₂ и IF₃. Все они получены в высокоочищенном состоянии с молекулярными массами 80 000, 75000 и 30000 соответственно. IF₃ обеспечивает узнавание участка на мРНК, куда присоединяется формил-метионил-тРНК. Этот белковый фактор первым связывается со свободной 30S субчастицей рибосомы. IF₁ способствует связыванию формил-метионил-тРНК с 30S субчастицей рибосомы и присоединению к последней мРНК. Второй белковый фактор IF₂, вероятнее всего, способствует объединению 30S и 50S субчастиц после того, как на первой уже присутствуют инициирующие кодоны мРНК, N-формил-метионил-тРНК, IF₃, IF₁ и ГТФ. Этот белок рассматривают как фактор стабилизации всего комплекса. Аналогичные белковые факторы инициации открыты также в клетках животных. Их принято обозначать M₁, М₂ и М₃. В синтезе белка их роль тождественна роли инициаторных белков у Е. coli.

Образование инициаторного комплекса

Имеется много экспериментальных доказательств, что в процессе белкового синтеза наблюдаются постоянная диссоциация 70S рибосомы на 30S и 50S субчастицы и последующая их реассоциация. Сначала образуется инициаторный комплекс путем присоединения белковых факторов, формил-метионил-тРНК и ГТФ к 30S субчастице рибосомы, к которой комплементарно антикодону формил-метионил-тРНК присоединяется мРНК (с кодоном АУГ) (рис. 113).

Следует указать на особую роль формил-метионил-тРНК, которая помогает мРНК найти на 30S субчастице определенное положение, обеспечивающее трансляцию информации о последовательности аминокислот в полипептидной цепи. Как только мРНК присоединяется к комплексу, высвобождается белковый фактор IF₃; оставшийся комплекс легко присоединяет 50S рибосому, образуя транслирующую, т. е. функционально-активную 70S рибосому. В процессе этих перестроек рибосомы освобождают остальные белковые факторы инициации и продукты гидролиза ГТФ (ГДФ в неорганический фосфат), энергия которого расходуется, по-видимому, на конформационные изменения-70S рибосомы, в результате которых формил-метионил-тРНК из аминоацильного центра перемещается в пептидильный центр рибосомы. В гидролизе ГТФ принимают участие IF₂ и, вероятно, обе субчастицы рибосомы. У образовавшейся активной рибосомы 70S оказывается свободный аминоацильный центр, который может реагировать с определенной аа-тРНК в строгом соответствии с очередным кодоном мРНК. С этого момента начинается второй этап синтеза - элонгация.

Элонгация трансляции

Процесс элонгации полипептидной цепи у Е. coli непосредственно, точнее топографически, связан с большей субчастицей (50S) рибосомы, содержащей два центра для связывания тРНК: один из них называется амоноацильным, другой - пептидильным центром (рис. 114).

В процессе элонгации у Е. coli также участвуют три белковых фактора, обозначаемых EF-Tu, EF-Ts и EF-G (т. е. элонгационные факторы трансляции U, S и G), а у эукариотов известно два таких фактора, названных трансляционными факторами: TF-1 и TF-2. Почти все они получены в чистом виде - это белки с большой молекулярной массой (от 70 000 до 200 000).

Процесс элонгации требует также наличия ГТФ, энергия гидролиза которого необходима для сближения аа-тРНК, расположенной на аминоацильном центре, и формил-метионил-тРНК, локализованной на пептидильном центре. Элонгация начинается со связывания аа-тРНК (аминокислотный остаток которого является вторым с N-конца после формил-метионина) с белковыми факторами и присоединения всего комплекса к аминоацильному центру в соответствии с кодовым триплетом на мРНК. Далее в пептидильном центре осуществляется ферментативная реакция транспептидирования между формил-метионил-тРНК и аа-тРНК; в процессе этой реакции остаток формил-метионина переносится на свободную NH₂-группу аа-тРНК, и замыкается первая пептидная связь в будущей полипептидной цепи; параллельно освобождается тРНК^фмет. Фермент, катализирующий эту реакцию, получил название пептидил-трансферазы (рис. 115).

Для дальнейшего процесса элонгации требуется, чтобы аминоацильный центр был свободным для следующей аа-тРНК. Для этого в следующей стадии благодаря процессу "транслокации" пептидил-тРНК переносится из аминоацильного на пептидильный центр. Достигается транслокация благодаря миграции рибосомы относительно мРНК при участии фермента "транслоказы", фактора элонгаций EF-G у Е. coli и TF-2 у эукариотов, а также энергии распада ГТФ. В результате транслокации дипептидил-тРНК занимает место в пептидильном центре рибосомы, а аминоацильный центр, будучи „вакантным”, может присоединить новую аа-тРНК в соответствии с кодоном мРНК. Укажем также, что параллельно с транслокацией перемещается и мРНК точно на один триплет. Сказанное можно иллюстрировать схемой (рис. 116).

Таким образом, в стадии элонгации происходит последовательное наращивание полипептидной цепи по одной аминокислоте в строгом соответствии с порядком триплетов (кодонов) в молекуле мРНК.

Терминация процесса трансляции

Завершение синтеза полипептидной цепи в 70S рибосоме осуществляется при участии трех белковых факторов реализации: RF-1, RF-2 и RF-3 у Е. coli. В клетках животных открыт единственный белок с аналогичным свойством - фактор R. Первые два фактора у Е. coli обладают свойством распознавания в молекуле мРНК терминирующих кодонов (УАГ, УАА и УГА). После того как терминирующий кодон мРНК займет свое место в аминоацильном центре рибосомы, к нему присоединяется один из белковых факторов терминации и блокируется дальнейшая элонгация цепи.

Считается, что терминирующие кодоны и белковые факторы индуцируют пептидилэстеразную активность одного или двух рибосомных белков 50S субчастицы, причем разрывается сложноэфирная связь между синтезированным полипептидом и тРНК. Следствием этого являются отделение белковой молекулы от рибосомы, освобождение тРНК и мРНК (последняя подвергается распаду до свободных рибонуклеотидов); одновременно 70S рибосома распадается на две свои субчастицы 30S и 50S, которые поступают в свободный пул и могут вновь использоваться для реассоциации рибосомы. ГТФ в терминации трансляции у Е. coli рассматривается в качестве аллостерического регулятора, а у эукариотов ГТФ, вероятнее всего, распадается на ГДФ и Фн.

Синтезированная полипептидная цепь далее подвергается деформилированию при участии специфического фермента - пептидил-деформилазы. Возможно, что от полипептида отщепляется также концевой метионин. В клетках животных открыт фермент аминопептидаза, катализирующая отщепление N-концевого метионина.

Таким образом, в общей форме зависимость между репликацией ДНК, транскрипцией и трансляцией мРНК может быть представлена в следующей модифицированной схеме, заимствованной из работы Уотсона (рис. 117).

Синтез митохондриальных белков

Известно, что в митохондриях клеток высших организмов содержится до 2% клеточной ДНК, отличающейся от ДНК ядра. Кроме того, митохондрии содержат весь аппарат, включая рибосомы, тРНК и мРНК, необходимый для синтеза определенных белков. Тщательный анализ показал, что синтезируемые в митохондриях белки в основном относятся к нерастворимым белкам, участвуя в организации структуры этих органелл, в то время как источником синтеза растворимых митохондриальных белков являются рибосомы цитоплазмы, откуда они транспортируются в митохондрии. Выяснено также, что рибосомы в митохондриях имеют меньший размер, чем 80S рибосомы в цитоплазме. Самым интересным явлением оказался тот факт, что в качестве инициирующей аминокислоты при синтезе белка участвует N-формил-метионин, а не свободный метионин, как во всех рибосомах цитоплазмы эукариотов. Это обстоятельство свидетельствует о том, что митохондриальный синтез белка по своему механизму находится ближе к синтезу у прокариотов.

Мультиферментный механизм синтеза пептидов. Накопленные к настоящему времени фактические данные показывают, что матричный механизм синтеза лежит в основе синтеза почти всех белков живых организмов. Тем не менее синтез ряда низкомолекулярных пептидов может осуществляться не только без участия нуклеиновых кислот, в частности без мРНК, но даже в отсутствие рибосомы. На X Международном биохимическом конгрессе в Гамбурге в 1976 г. Липман (США) и Курахаси (Япония) представили экспериментальные доказательства синтеза двух природных пептидных антибиотиков - грамицидина S и тироцидина в экстрактах, полученных из Bacillus brevis. В частности, выделенные из экстрактов В. brevis две белковые фракции обеспечивали точность сборки циклического полипептида - грамицидина S, состоящего из 10 аминокислотных остатков, расположенных в строгой последовательности. Очищенные белковые фракции (с молекулярными массами 100 000 и 280 000) требовали присутствия только свободных аминокислот, АТФ и Mg²⁺ для синтеза in vitro этого циклического декапептида:

Показано, что именно легкая белковая фракция (молекулярная масса 100 000) обеспечивает рацемизирование и включение D-фенилаланина в первую полипептидную цепь, а тяжелая (молекулярная масса 280 000) - включение 4 остальных L-аминокислот. Аналогично синтезируется такой же пентапептид на расположенном рядом мультиферментном комплексе, затем оба пентапептида соединяются по типу "голова к хвосту" с замыканием цепи и образованием циклического декапептида. В механизме синтеза предполагается предварительное образование аминоациладенилатов (при участии этих же ферментов), из которых остатки аминокислот затем переносятся на SH-группы ферментов.

Аналогичный механизм синтеза доказан и для декапептида - антибиотика тироцидина и 13-членного циклического пептида - антибиотика микобациллина.

Представленный материал свидетельствует о том, что природа (бактерии), очевидно, не утратила полностью существовавший до матричного рибосомного пути механизм синтеза белковых тел, пользуясь для этого весьма примитивными, но совершенными орудиями.

Продолжение: Регуляция синтеза белка