Предыдущая: Активирование и ингибирование ферментов

Внутриклеточная локализация ферментов

Вопрос о локализации ферментов в структурных образованиях клетки (ядро, митохондрии, микросомы и др.) является чрезвычайно важным, особенно в препаративной энзимологии, когда перед исследователем поставлена задача изолирования и выделения фермента в чистом виде. Сравнительно легко, обнаружить локализацию фермента методами цито- и гистохимии. Для этого тонкие срезы органа инкубируют с соответствующими субстратами и после инкубации локализацию продукта реакции открывают добавлением подходящих химических реактивов по развитию специфической окраски.

В препаративной энзимологии чаще всего пользуются методом дифференциального центрифугирования гомогенатов тканей. Для этого сначала разрушают клеточную структуру с помощью подходящего дезинтегратора (см. Химия белков) и полученную квазиоднородную (гомогенизированную) массу подвергают дифференциальному центрифугированию при температуре от 0 до 4°С. Примерная схема дифференциального центрифугирования гомогенатов в высокоскоростных центрифугах представлена на рис. 60. Обычно распределение ферментов изучают в последовательных индивидуальных фракциях, изолированных при дробном центрифугировании гомогенатов, в частности во фракции ядер, которую получают при низкой скорости центрифугирования, во фракции митохондрий, которая осаждается при средней скорости центрифугирования, во фракции микросом (или рибосом), для изолирования которой требуется очень высокая скорость центрифугирования, и, наконец, в оставшейся прозрачной жидкости (супернатант), представляющей собой растворимую фракцию цитоплазмы. Следует указать, что фракция митохондрии не является гомогенной, поскольку из нее удается изолировать частицы, известные как "лизосомы", размер, которых занимает промежуточное место между размерами митохондрий и микросом. В свою очередь микросомальная фракция также является гетерогенной, поскольку она имеет своим источником эндоплазматический ретикулум неоднородного строения.

При помощи метода фракционирования в центрифугах было показано, что ядерная фракция печени и почек содержит незначительное число ферментов, хотя известно, что в ядрах осуществляется синтез некоторых белков. Основным же местом синтеза белка, как теперь установлено, является фракция рибосом цитоплазмы. Показано, кроме того, что ферменты гликолиза сосредоточены преимущественно в растворимой фракции цитоплазмы, в то время как цитохромоксидаза и ферменты лимоннокислого цикла Кребса локализованы во фракции митохондрий. С митохондриями связаны также ферменты, катализирующие окислительное фосфорилирование и распад жирных кислот. Ферменты, катализирующие биосинтез жирных кислот, наоборот, содержатся в растворимой фракции цитоплазмы (см. Обмен веществ).

Для изолирования и выделения ферментов из биообъектов в чистом (гомогенном) состоянии используется весь арсенал методов выделения белков в индивидуальном виде, который был подробно рассмотрен выше (см. Химия белков).

Классификация и номенклатура ферментов

Современная классификация и номенклатура ферментов была разработана Комиссией по ферментам¹ Международного биохимического союза и утверждена на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г. в Москве. ¹ В работе Комиссии принимали участие крупнейшие энзимологи мира, в том числе от нашей страны акад. А. Е. Браунштейн.

Необходимость систематики номенклатуры диктовалась прежде всего стремительным ростом числа вновь открываемых с каждым годом ферментов, которым разные исследователи присваивали названия по своему усмотрению. Более того, для одного и того же фермента подчас употребляли два или несколько названий, что вносило путаницу в номенклатуру. Некоторые названия ферментов вообще не отражали тип катализируемой реакции. Учитывая эти обстоятельства, Комиссия рекомендовала употреблять названия, оканчивающиеся на "аза", только для индивидуальных ферментов, но не для комплексных ферментных систем, т. е. для систем, содержащих более одного фермента.

До 1961 г. не было также единой классификации ферментов. Трудности заключались в том, что разные исследователи за основу классификации ферментов брали различные принципы. Комиссией были рассмотрены три принципа, которые могли служить основой для классификации ферментов и их обозначения. Первый принцип — химическая природа фермента, т. е. принадлежность к флавопротеидам, пиридоксальфосфатпротеидам, гемопротеидам, металлопротеидам и т. д. Однако этот принцип не мог служить общей основой для классификации, так как только для небольшого числа ферментов известны простетические группы, доступные идентификации и прямому определению. Второй принцип — химическая природа субстрата, на который действует фермент; по этому принципу трудно классифицировать ферменты, так как в качестве субстрата могут служить разнообразные соединения внутри определенного класса веществ (белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты) и бесчисленного множества промежуточных продуктов их обмена. В основу принятой классификации положен тип катализируемой реакции, который является специфичным для действия любого фермента; этот принцип логично использовать в качестве основы для классификации и номенклатуры ферментов.

Таким образом, тип катализируемой химической реакции в сочетании с названием субстрата (субстратов) и служит основой для систематического наименования ферментов. Согласно этой классификации ферменты делят на шесть главных классов:

1. оксидоредуктазы [показать]

   К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисления. Названия их составляются по форме "донор: акцептор-оксидоредуктаза", например лактат: НАД⁺-оксидоредуктаза¹. ¹Этот фермент катализирует перенос протонов (и электронов) от окисляемого субстрата (т. е. молочной кислоты) на никотинамидадениндинуклеотид (НАД), являющийся коферментом многих дегидрогеназ (см. Витамины).

   Различают следующие основные оксидоредуктазы: аэробные дегидрогеназы или оксидазы, катализирующие перенос протонов (электронов) непосредственно на кислород, анаэробные дегидрогеназы, ускоряющие перенос протонов (электронов) на промежуточный субстрат, но не на кислород, цитохромы, катализирующие перенос только электронов. К этому классу относятся также каталаза и пероксидаза, катализирующие соответственно перенос двух атомов водорода с одной молекулы перекиси водорода на другую молекулу и с субстратов (включая восстановленные пиридиновые и флавиновые ферменты) на перекись водорода.

2. трансферазы [показать]

   К классу трансфераз относят ферменты, катализирующие реакции внутри- и межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов и радикалов. Наименование их составляется по форме: "донор-транспортируемая группа - трансфераза".

   Различают трансферазы, катализирующие перенос одноуглеродных остатков, ацильных, гликозильных, альдегидных или кетонных, нуклеотидных остатков,азотистых групп, остатков фосфорной и серной кислот и др. Например: метил- и формилтрансферазы, ацилтрансферазы, гексозилтрансферазы, аминотрансферазы, фосфотрансферазы и др.

3. гидролазы [показать]

   В класс гидролаз входит большая группа ферментов, катализирующих расщеплeние внутримолекулярных связей органических веществ при участии молекулы воды. Наименование их составляется по форме: "субстрат — гидролаза". К ним относятся: эстеразы — ферменты, катализирующие реакции гидролиза и синтеза сложных эфиров, гликозидазы, ускоряющие разрыв гликозидных связей, фосфатазы, и пептидгидролазы, катализирующие гидролиз фосфоангидрильных и пептидных связей, амидазы, ускоряющие разрыв кислотно-ангидридных связей, отличных от пептидных, и др.

4. лиазы [показать]

   К классу лиаз относят ферменты, катализирующие обратимые реакции отщепления различных групп от субстратов не гидролитическим путем; эти реакции сопровождаются образованием двойной связи или присоединением групп к месту двойной связи. Они обозначаются термином "субстрат-лиаза". Например, фумарат-гидратаза (систематическое название: L-малат-гидролиаза) катализирует обратимое отщепление молекулы воды от яблочной кислоты с образованием фумаровой кислоты.

   В эту же группу входят декарбоксилазы (карбоксилиазы), амидинлиазы и др.

5. изомеразы [показать]

   К классу изомераз относят ферменты, катализирующие различные типы реакций изомеризации. Систематическое название их составляется с учетом типа реакции по следующему образцу: субстрат-цис-(транс)-изомераза. Если изомеризация включает внутримолекулярный перенос группы, фермент получает название мутазы.

   К классу изомераз относятся рацемазы и эпимеразы, действующие на амино- и оксикислоты, углеводы и их производные, внутримолекулярные оксидоредуктазы, катализирующие взаимопревращения альдоз и кетоз, внутримолекулярные трансферазы, переносящие ацильные, фосфорильные и другие группы и т. д.

6. лигазы (синтетазы) [показать]

   К классу лигаз относят ферменты, катализирующие синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада АТФ (или другого нуклеозидтрифосфата). Систематическое название их составляется по форме: "Х-У-лигаза", где через Х-У обозначаются исходные вещества. В качестве примера можно назвать глутамат-аммиак-лигазу (синтетазу), при участии которой из глутаминовой кислоты и аммиака в присутствии АТФ синтезируется глутамин.

Список ферментов

На основании разработанной системы, которая служит основой как для классификации, так и для нумерации (индексации) ферментов, Международная комиссия подготовила также Классификацию ферментов (КФ) с включением списка ферментов, первоначально состоявшего к 1961 г. примерно из 900 ферментов. В настоящее время в списке ферментов (см. Номенклатуру ферментов, 1978) насчитывается уже 2142 индивидуальных фермента. В списке для каждого фермента, помимо номера (шифра), приводятся систематическое (рациональное) название, рекомендуемое (рабочее) название, химическая реакция, которую катализирует данный фермент, а также примечания о специфичности действия. Присвоение шифра или номера для фермента рекомендуется проводить по четырехзначному коду.

Таким образом, код, или шифр, каждого фермента содержит четыре цифры, разделенные точками, и составляется по следующему принципу. Первая цифра указывает на номер одного из шести главных классов ферментов (см. выше). Вторая цифра означает подкласс, характеризующий основные виды субстратов, участвующих в данном типе химических превращений. Например, у трансфераз вторая цифра указывает на природу той группы, которая подвергается переносу, у гидролаз — на тип гидролизуемой связи и т. д. Эти подклассы в свою очередь, делятся на более частные подгруппы (обозначаемые под-подклассами), отличающиеся природой химических соединений доноров или акцепторов, участвующих в данной подгруппе реакций. Номер, точнее цифра, подподкласса ставится на третьем месте в шифре фермента. У гидролаз, например, эта цифра уточняет тип гидролизуемой связи, а у лиаз — тип отщепляемой группы и т. д. Первые три цифры кода точно определяют тип фермента. Наконец, все ферменты, относящиеся к данному под-подклассу, получают порядковый номер, который ставится на четвертом месте кода.

Таким образом, каждый фермент, характеризующийся постоянной совокупностью четырех цифр, имеет соответствующий шифр. В стандартной классификации этим путем охарактеризовано более 2100 ферментов; в качестве примера в табл. 19 приводятся два фермента из списка.

Таблица 19. Фрагмент из списка ферментов
Шифр	Систематическое название	Рекомендуемое (рабочее) название	Pеакция	Примечания о специфичности и другие зависимости
КФ 1.1.1.27	L-Лактат + НАД+ - оксидоредуктаза	Лактатдегидрогеназа	L-Лактат + НАД+ <--> пируват + НАДН2	Окисляет и другие гидроксимонокарбоновые кислоты
КФ 2.6.1.5	L-Тирозин: 2- оксоглутарат- аминотрансфераза	Тирозинаминдтрансфераза	L-Тирозин + 2-оксоглутарат <--> 4-гидроксифенил-пируват + L-Глутамат	Протеид пиридоксальфосфата

Следует особо подчеркнуть, что Международную классификацию ферментов нельзя считать абсолютно совершенной, поскольку она в некоторых отношениях не соответствует общепринятой в органической химии классификации химических реакций, несмотря на то что ферменты катализируют по существу те же реакции.

Применение ферментов

Ферменты являются в высшей степени избирательными инструментами, используемыми живыми организмами для осуществления с высокой скоростью огромного разнообразия химических реакций; они могут сохранять активность вне организма, в микропространстве клетки, уже давно привлекают внимание ученых и широко применяются в народном хозяйстве и медицине. Ферменты нашли широкое применение в таких отраслях промышленности, как хлебопечение, пивоварение, виноделие, чайное, кожевенное и меховое производство, сыроварение, кулинария (для обработки мяса) и т. д. В последние годы ферменты стали применять и в тонкой химической индустрии для осуществления таких реакций органической химии, как окисление, восстановление, дезаминирование, декарбоксилирование, дегидратация, конденсация, а также для разделения и выделения изомеров аминокислот L-ряда (при химическом синтезе образуются рацемические смеси L- и D-изомеров), нашедших применение в промышленности, сельском хозяйстве, медицине. Следует указать, что овладение тонкими механизмами действия ферментов, несомненно, предоставит неограниченные возможности получения в огромных количествах и с высокой скоростью полезных веществ в лабораторных условиях почти со 100% выходами.

Успехи энзимологии находят все большее применение в медицине, в частности во многих аспектах здоровья и болезни, диагностики и лечения. Успешно развивается новое направление энзимологии — медицинская энзимология, имеющая свои цели и задачи, специфические методологические подходы и методы исследования. Медицинская энзимология развивается по трем главным направлениям, хотя возможности применения достижений энзимологии в медицине теоретически безграничны, в частности в области энзимопатологии, имеющей целью исследование ферментативной активности в норме и патологии. Многие наследственные пороки обмена, как оказалось, являются результатом дефекта определенного фермента. Так, галактоземия — наследственное заболевание, при котором наблюдается ненормально высокая концентрация галактозы в крови, развивается в результате наследственного дефекта синтеза ключевого фермента — галактозофосфат-уридил-трансферазы, катализирующего превращение галактозы в легко метаболизируемую глюкозу. Причиной другого наследственного заболевания — фенилкетонурии, сопровождающейся расстройством психической деятельности, является потеря клетками печени способности синтезировать фермент, катализирующий превращение фенилаланина в тирозин (см. Обмен аминокислот).

Второе направление медицинской энзимологии получило наименование энзимодиагностики, которая развивается как по пути применения высокоочищенных ферментов в качестве избирательных реагентов для открытия и количественного определения с диагностической целью нормальных или аномальных химических веществ в биологических жидкостях (моча, кровь, желудочный сок и др.), так и по пути обнаружения (открытия) самих ферментов в сыворотке крови при поражениях органов и тканей, например определение при помощи ферментов сахара, белка и других патологических составных частей мочи при заболеваниях почек, сердца и т. д. Для диагностики органических поражений органов широко используются ферментные тесты, выгодно отличающиеся от других химических диагностических тестов, используемых в клинике, высокой чувствительностью и специфичностью; сейчас известно около двух десятков тестов, основанных на количественном определении активности ферментов (и изоферментов) главным образом в крови (реже в моче), а также в биоптатах. Следует, однако, отметить, что из огромного числа ферментов (более 2000); открытых в природе (частично и в организме человека), в диагностической энзимологии используется лишь ограниченный набор ферментов и при весьма узком круге болезней (гепатиты, инфаркт миокарда, органические поражения печени и др.). Сейчас получены доказательства, что органы и ткани человека характеризуются специфическим ферментным и изоферментным спектром, подверженным не только индивидуальным, но и суточным колебаниям. Существует большой градиент концентрации ферментов между внутриклеточными и внеклеточными частями тела. Поэтому любые, даже незначительные повреждения клеток (а иногда и функциональные расстройства) приводят к выделению ферментов во внеклеточное пространство, откуда они поступают в кровь. Механизм гиперферментемии до конца не расшифрован. Степень повышения содержания внутриклеточных ферментов в плазме крови находится в прямой зависимости от природы повреждающего воздействия, времени действия и от степени повреждения органов. В оценке ферментных тестов для диагностических целей особое значение имеет знание периода полу-жизни в плазме крови каждого из диагностических ферментов. Отсюда становится важным выбор точного времени ферментного анализа крови. Весьма существенным является также знание особенностей распределения (топографии) ферментов в индивидуальных органах и тканях, как и внутриклеточной локализации.

Дальнейшее развитие диагностической энзимологии преимущественно идет по двум перспективным направлениям медицинской энзимологии: по пути упрощения и рациональной модификации уже испытанных методов и по пути поиска новых органоспецифичных (тканеспецифичных) ферментов и изоферментов.

Третье направление медицинской энзимологии — энзимотерапия, т. е. использование ферментов и регуляторов действия ферментов в качестве лекарственных средств, пока имеет небольшую историю. До сих пор работы в этом направлении почти не выходят за экспериментальные рамки. В клинике нашли применение пепсин, трипсин, химотрипсин и их смеси (абомин, химопсин) для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта. Помимо протеиназ, ряд других ферментов, в частности РНК-аза, ДНКаза, гиалуронидаза, коллагеназы, эластазы, отдельно или в смеси с протеиназами используются для обработки ран, воспалительных очагов, ожогов, для устранения отеков, гематом, келоидных рубцов (туберкулез легких). Ферменты применяются также для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, для растворения сгустка крови и т. д. Так, калликреины — ферменты кининовой системы — используются для снижения кровяного давления. Важной и многообещающей областью энзимотерапии является применение ингибиторов ферментов. Так, естественные ингибиторы протеиназ нашли применение в терапии острых панкреатитов, артритов, аллергических заболеваний, при которых имеет место активация протеолиза и фибринолиза, сопровождающаяся образованием вазоактивных кининов.

Новой перспективной областью медицинской энзимологии является применение иммобилизованных ферментов, их активаторов и ингибиторов. Такие формы ферментов, сохраняя каталитическую активность обладают повышенной стабильностью, сниженной антигенностью и более длительным действием в организме. Уже созданы иммобилизованные лекарственные препараты фибринолитических ферментов, применяемые для борьбы с тромбозами.

В последние годы разрабатывается новый способ введения иммобилизованных ферментов путем внедрения их в липидные пузырьки-липосомы, которые оказались хорошими носителями для транспорта лекарств в организме; они биосовместимы, не вызывают иммунологических реакции и с их помощью можно вводить ферменты внутрь клеток.

Предпринимались попытки применения ферментов для лечения злокачественных опухолей человека, например аспарагиназы при лечении лимфогранулематоза. Этот фермент разрушает аспарагин, являющийся незаменимым фактором для лейкозных клеток, поскольку они оказались лишенными способности его синтезировать. Следует однако, подчеркнуть, что в этой огромной важности проблеме применения ферментов и их эффекторов в качестве лекарственных препаратов в значительной степени господствует эмпиризм и задача заключается в том, чтобы как приготовление ферментов, так и применение их в клинике организовать на строго научной основе. Это, несомненно, окажет практическим врачам ценную помощь в борьбе с заболеваниями человека.