Ферменты, или энзимы, представляют собой высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемых живыми организмами для осуществления многих тысяч взаимосвязанных химических реакций, включая синтез, распад и взаимопревращения огромного множества и разнообразия химических соединений. Жизнь и многообразие ее проявлений — сложная совокупность химических реакций, катализируемых специфическими ферментами. И. П. Павлов считал ферменты "возбудителями всех химических превращений" у живых существ. Как известно, важнейшим свойством живого организма является обмен веществ, ускоряющим и направляющим аппаратом, основой молекулярных механизмов которого являются ферменты. "Вся тайна животной жизни, — писал Д. И. Менделеев, — заключается в непрерывных химических превращениях веществ, входящих в состав животных тканей".

В наше время теоретические и практические достижения энзимологии занимают ведущее место в решении многих проблем биохимии и молекулярной биологии, включая их сравнительное и эволюционное рассмотрение. "Под знаком молекулярной энзимологии,— говорил на III Всесоюзном биохимическом съезде (1974) А. Е. Браунштейн, — развивается и встречное течение — реконструкция или интеграция, восходящая от молекулярного яруса к высшим уровням структурно-функциональной организации живого и пронизывающая весь комплекс актуальных проблем биологии и медицины".

Ферменты отличаются рядом характерных свойств от неорганических катализаторов. Прежде всего ферменты чрезвычайно эффективны и проявляют высокую каталитическую активность в условиях умеренной температуры (температура тела), нормального давления и в области близких к нейтральным значениям pH среды.

Ферменты отличаются высокой специфичностью действия в отношении как природы субстрата, так и типа химической реакции, т. е. каждый фермент катализирует в основном только одну какую-либо химическую реакцию. Для каждого фермента характерны специфическая последовательность расположения аминокислотных остатков и пространственная конформация. Существенной особенностью ферментов является также то, что их активность в клетках строго контролируется как на генетическом уровне, так и посредством определенных низкомолекулярных соединений: субстратов и продуктов реакций (эффекторов), катализируемых этими же ферментами. Таким образом, молекула фермента характеризуется уникальностью структуры, которая и определяет уникальность ее функции.

Учение о ферментах выделено в самостоятельную науку — энзимологию, или ферментологию. Термин "энзим" (от греч. en zyme — в дрожжах), так же как и "фермент" (от латинск. fermentatio — брожение), означает процесс, связанный с выделением газов. Термином "фермент" называли любой агент, вызывающий тот или иной вид брожения, хотя, как мы увидим ниже, это понятие является более широким.

В настоящее время учреждены специальные научно-исследовательские институты по изучению ферментов, существует ряд специальных журналов, созываются национальные и международные симпозиумы и конференции, посвященные проблемам энзимологии. Наука о ферментах интенсивно развивается в тесной связи со многими науками, в частности с органической, неорганической и физической химией, физиологией, токсикологией, микробиологией, генетикой, фармакологией и др. Таким образом, эта область знаний находится на стыке химических, биологических и медицинских наук.

Энзимология в ее современном физико-химическом и молекулярном понимании решает две главные неразрывно связанные между собой проблемы, касающиеся, с одной стороны, структурной макромолекулярной организации ферментов, с другой, — природы химических взаимодействий, лежащих в основе ферментативного катализа. По этим вопросам накопление экспериментальных данных и развитие теоретических представлений происходят настолько быстро, что любой учебник к моменту выхода в свет уже не отражает достаточно полно современное состояние вопроса о структуре и функции ферментов.

Важно подчеркнуть, что изучение ферментов имеет огромное значение для любой фундаментальной и прикладной области биологии, а также для многих практических отраслей химической, пищевой и фармацевтической индустрии, занятых приготовлением катализаторов, антибиотиков, витаминов и многих других биологически активных веществ, используемых в народном хозяйстве и медицине. На рис. 36 представлены основные области биологии и медицины, в которых идеи и методы энзимологии нашли широкое применение. В фармакологии действие многих лекарственных препаратов основано на определенном, хотя зачастую еще не выявленном, механизме взаимодействия их с ферментами. Успехи общей и молекулярной энзимологии способствуют развитию новой ее ветви — медицинской энзимологии, цели и задачи, методологические подходы которой связаны с решением проблем энзимопатологии, энзимодиагностики и энзимотерапии. Наука о питании базируется на точных знаниях поэтапного расщепления питательных веществ под влиянием ферментов пищеварительного аппарата, на количественный и качественный состав которых существенно влияет характер поступающих с пищей веществ. Многие проблемы наследственной патологии человека тесно связаны с дефектами или полным отсутствием синтеза специфических ферментов. Проблемы клеточного роста и развития, дифференцировки, физиологических функций (движение, перемещение в пространстве, транспорт веществ, процессы возбуждения и торможения и др.) определяются в большей степени работой биокатализаторов, включая их биосинтез и инактивацию. Таким образом, есть все основания для подтверждения положения, что не только современная биология, как отмечает акад. А. Е. Браунштейн, но и медицина "говорят на языке энзимологии".

КРАТКАЯ ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ УЧЕНИЯ О ФЕРМЕНТАХ

Несмотря на то, что явления брожения и переваривания известны с незапамятных времен, зарождение учения о ферментах (энзимология) относится к первой половине XIX века. Первое научное представление о ферментах было дано в 1814 г. петербургским ученым К. С. Кирхгофом, который показал, что не только проросшие зерна ячменя, но и экстракты из солода способны осахаривать крахмал с превращением его в мальтозу. Вещество, извлекаемое из проросшего ячменя и обладающее способностью превращать крахмал в мальтозу, получило название амилазы. Либих и Велер открыли другой агент, расщепляющий амигдалин, содержащийся в эфирном масле горького миндаля. Действующий агент, содержащийся в миндале, был назван эмульсином. В последующие годы были описаны другие ферменты, в частности, пепсин и трипсин, вызывающие гидролиз белков в желудочно-кишечном тракте.

Наибольшее внимание исследователей привлекали процессы окисления в организме. Уже был известен феномен химического катализа, означающий, что и многие реакции in vitro протекают быстро и энергично в присутствии ничтожных количеств примесей, как будто не участвующих в реакции. В частности, была установлена высокая каталитическая роль ряда неорганических веществ. Горение сахара на воздухе, например, происходит очень медленно, если же добавить немного солей лития (или золы, также содержащей ничтожные количества лития), то горение сахара идет весьма интенсивно в соответствии со следующим уравнением:

С₆Н₁₂О₆ + 60₂ --> 6СO₂ + 6Н₂0

Как известно теперь, в живых организмах "горение" (а точнее окисление) углеводов также протекает быстро и до тех же конечных продуктов обмена, т. е. СO₂ и Н₂O с выделением (и накоплением) энергии. Однако это "горение" происходит при относительно низкой температуре, без пламени и, что особенно интересно, в присутствии воды. Разумеется, в этих необычных условиях без действия ферментов, получивших наименование биологических катализаторов, не было бы окисления сахаров. Забегая несколько вперед, укажем, что в процессе превращения (окисления) глюкозы в организме до СО₂ и Н₂O участвует последовательно около 15 различных ферментов (см. Обмен углеводов).

Биологические катализаторы, т. е. ферменты, как оказалось, не вызывают, в отличие от неорганических катализаторов, каких-либо других (побочных) реакций, и не осуществляют реакций, невозможных по термодинамическим условиям, но и те, и другие катализаторы только ускоряют химические реакции, обычно протекающие очень медленно. В качестве примера можно привести одну и ту же химическую реакцию, на которую действует и фермент, и неорганический катализатор. Так, перекись водорода может медленно расщепляться на молекулярный кислород и воду и в отсутствие катализатора, но в присутствии мелкораздробленной платины эта реакция протекает с высокой скоростью:

Эту же реакцию можно провести, и притом еще намного быстрее, в присутствии фермента каталазы, содержащейся, в частности, в эритроцитах, причем образуются те же конечные продукты распада перекиси водорода. Аналогично ионы меди и особый фермент аскорбатоксидаза интенсивно катализируют окисление аскорбиновой кислоты (витамин С) молекулярным кислородом в дегидроаскорбиновую кислоту (см. ниже).

Таким образом, можно считать установленным, что ферменты катализируют ряд химических реакций, аналогичных химическим реакциям, катализирующимся неорганическими веществами.

Ферменты долгое время подразделяли на "организованные" и "неорганизованные" в зависимости от того, удавалось или не удавалось осуществить изучаемую химическую реакцию in vitro в отсутствие живых клеток. В частности, связана ли химическая реакция с жизнедеятельностью клеток микроорганизмов? Дискуссия велась, главным образом, вокруг вопроса о сущности дрожжевого брожения и вызвала знаменитую полемику между Л. Пастером и Ю. Либихом.

Пастер опубликовал серию работ, где показал, что спиртовое брожение осуществляется цельными, неповрежденными дрожжевыми клетками. По его мнению, процесс брожения обусловлен размножением дрожжевых клеток, т. е. их жизнедеятельностью; отсюда и их название "организованные" ферменты, ферменты живой клетки, ферменты "существа". После нагревания дрожжевые клетки теряли свою способности сбраживать сахар. Пастер, однако, не отрицал существования и "неорганизованных" ферментов, т. е. ферментов "веществ", в частности амилазы, эмульсина, пепсина и др. Подобное противопоставление ферментов "существ" и "веществ" имело явно виталистический характер и напоминало противопоставление живой и неживой природы. Либих, будучи химиком, напротив, считал, что "организованных" ферментов вообще не существует и что спиртовое брожение и сходные процессы обусловлены действием химических веществ, которые могут быть выделены из дрожжевой клетки или любого другого объекта живой природы. Однако Либиху не удалось выделить эти вещества, и спор не был разрешен.

Только в 1871 г. М. М. Манассеина впервые показала, что дрожжи и после разрушения клеточной структуры (растертые с измельченным песком), когда фактически они лишены жизненных функций, способны сбраживать сахар. Работы Бухнера (1897) окончательно решили спор в пользу Либиха. Бухнер приготовил бесклеточный дрожжевой сок, полученный прессованием клеток под высоким давлением (до 500 ат), и, поскольку этот сок легко разлагался при хранении бактериями из воздуха, он в качестве консерванта добавлял сахар (эта функция сахара была известна при приготовлении джемов). К своему удивлению, он обнаружил, что бесклеточный сок из дрожжей сбраживал сахар с образованием спирта; таким образом, Бухнер показал, что присутствие живых организмов не обязательно для процесса брожения. Фермент брожения получил название зимазы (от греч. zyme — дрожжи). В лаборатории А. Н. Лебедева зимаза была получена более простым способом: настаиванием в теплой воде высушенных дрожжевых клеток.

Таким образом, благодаря исследованиям Бухнера и А. Н. Лебедева было положено начало детальному изучению процесса анаэробного окислительно-восстановительного расщепления углеводов, который вскоре был полностью расшифрован (см. Гликолиз). Эти же работы окончательно опровергли виталистические представления о сущности процесса брожения. В настоящее время считается установленным, что любую из протекающих в живых организмах (или клетках) химическую реакцию можно в принципе осуществить вне организма (или клетки), если экспериментатору удается выделить соответствующий фермент (или систему ферментов), катализирующий данную реакцию, и создать оптимальные условия для его действия¹.

¹ Ряд ферментов прочно связан с морфологическими структурами клетки, в частности с биомембранами. Для их изолирования и выделения требуется применение особых методических приемов, тогда как в целостном организме имеется тесная связь между функцией фермента и его структурной связью с клеточными образованиями.

ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА ФЕРМЕНТОВ

В настоящее время получены неопровержимые экспериментальные доказательства белковой природы ферментов. Трудно даже себе представить, что не только Вильштеттер еще в 1926 г. отрицал принадлежность ферментов к белкам или к какому-либо известному классу органических веществ, но и совсем недавно высказывались cомнения на этот счет. Поводом для сомнения являлись опыты, в которых, хотя и были получены ферментативно активные растворы, но белок не мог быть обнаружен при помощи качественных цветных реакций. Объясняется это тем, что концентрация фермента при высокой удельной активности оказывалась ниже пороговой чувствительности химического теста на белок.

О белковой природе ферментов говорит факт инактивирования (потери активности) ферментов брожения при кипячении, установленный еще Пастером. При кипячении имеют место явления необратимой денатурации (см. выше) белка-фермента. Фермент при этом теряет присущие ему свойства катализировать химическую реакцию. Точно так же белки при кипячении денатурируются и теряют свои биологические свойства (антигенные, гормональные, каталитические). Под влиянием различных физических и химических факторов (облучение растворов ферментов ультрафиолетовыми и рентгеновскими лучами, воздействие ультразвука, осаждение минеральными кислотами, щелочами, алкалоидными реактивами, солями тяжелых металлов и др.) происходит денатурация ферментов, так же как и белков.

Ферменты при гидролизе, как и белки, распадаются на аминокислоты что, бесспорно, служит веским доказательством белковой природы ферментов. Некоторые ферменты, помимо белковой части, содержат небелковый компонент, образуя молекулу сложного белка (см. Строение ферментов).

Поучительные данные, указывающие на белковую природу ферментов, были получены в лаборатории И. П. Павлова. При определении переваривающей способности желудочного сока была обнаружена прямая зависимость между этой способностью и количеством белка в соке. Отсюда было сделано заключение, что пепсин желудочного сока является белком.

Вескими доказательствами белковой природы фермента являются его получение в чистом виде и выделение в форме кристаллов белка. К настоящему времени получено более 200 кристаллических ферментов и структура многих из них изучена детально при помощи современных методов белковой химии и молекулярной физики (методами рентгеноструктурного анализа, ядерно-магнитного резонанса, электронно-магнитного резонанса и др.). Первый кристаллический фермент (уреаза) был получен в 1926 г. Самнером. Вслед за этим в 1930 г. Нортроп выделил в виде белковых кристаллов пепсин, в 1931 г. Нортроп и Кунитц получили из панкреатического сока кристаллический трипсин.

Ферменты, как и все белки, обладают рядом свойств, характерных для высокомолекулярных соединений; в частности, они наделены амфотерными свойствами (могут существовать в растворе в виде анионов, катионов и амфионов). Они также обладают электрофоретической подвижностью благодаря наличию в них положительных и отрицательных зарядов, а в изоэлeктрической точке не обнаруживают подвижности в электрическом поле. Ферменты не способны к диализу через полупроницаемые мембраны. При помощи диализа их растворы обычно можно освободить от низкомолекулярных примесей. Как белки они легко осаждаются из водных растворов при низких температурах методами высаливания (см. выше) или осторожным добавлением ацетона, этанола и др., не теряя при этом своих каталитических свойств.

Подобно белкам, ферменты обладают высокой молекулярной массой — от десятков тысяч до нескольких миллионов дальтон (табл. 14).

Ферменты обладают высокой специфичностью действия, что также доказывает их белковую природу, поскольку белки в иммунологическом отношении отличаются крайне тонкой специфичностью. Наконец, прямым доказательством белковой природы ферментов является лабораторный синтез первого и пока единственного¹ фермента — рибонуклеазы, осуществленный в лаборатории Мерифилда в Нью-Йорке. Этот автоматический синтез на твердой фазе состоял в последовательном включении всех 124 аминокислотных остатков в строгом соответствии с последовательностью аминокислот (с первичной структурой) естественного фермента — рибонуклеазы поджелудочной железы². Искусственно синтезированный фермент не отличался от природной рибонуклеазы по химическим, каталитическим и иммунологическим тестам.

¹ Полную первичную структуру панкреатической рибонуклеазы расшифровали в 1955 г. Мур и Стейн.
² Совсем недавно осуществлен искусственный синтез второго фермента — лизоцима, состоящего из 118 аминокислот.

Принимая во внимание перечисленные выше обстоятельства, при получении ферментов в чистом виде и при их хранении следует учитывать одно важное свойство белков, а именно стабильность, которая определяется рядом факторов. Одним из общих правил при работе с ферментами является оптимальная температура, соответствующая температуре тела, а для препаративных целей — пользование температурой около 0°С. Следует, однако, иметь в виду, что имеется несколько ферментов, весьма чувствительных к пониженной температуре, в частности, митохондриальный фермент, катализирующий распад АТФ, при 0°С подвергается инактивации, в то время как при комнатной температуре рн оказался стабильным. Большинство ферментов оказывается стабильными при pH около 6,0—8,0, хотя имеются исключения. Для препаративных целей часто прибегают к обезвоживанию фермента (удалению воды) в вакууме из замороженного раствора (этот метод получил название лиофилизации). Осаждение из раствора ферментов спиртом или ацетоном также проводят при низкой температуре, поскольку при комнатной температуре эти процедуры приводят к почти полной потере энзиматической активности.

Для стабилизации фермента часто пользуются хелатообразующими агентами, в частности, к ферменту добавляют этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), который может связывать нежелательные примеси (содержащиеся в реактивах следы ионов тяжелых металлов: меди, свинца, ртути и др.). оказывающие тормозящий эффект на активность. Одним из непременных условий сохранения cтабильности ферментов является хранение этих препаратов в высушенном или замороженном состоянии (в условиях холода). Многие ферменты стабильны в виде суспензии в концентрированных растворах сульфата аммония.

Продолжение: Строение ферментов