Одной из глобальных задач современной биологии и ее новейших разделов - молекулярной биологии, биоорганической химии, физико-химической биологии является расшифровка механизмов синтеза белковой молекулы чрезвычайной сложности, содержащей сотни, а иногда и тысячи остатков L-аминокислот. Последние располагаются не хаотично, а в строго заданной последовательности, обеспечивая уникальную структуру синтезированной белковой молекулы с уникальной функцией. Другими словами, механизм синтеза должен обладать точной кодирующей системой, которая автоматически программирует включение каждого аминокислотного остатка в определенное место полипептидной цепи. Кодирующая система определяет первичную структуру, а вторичная и третичная структуры белковой молекулы определяются физико-химическими свойствами и химическим строением аминокислот в полипептиде. Первоначальные представления, что синтез белка могут катализировать те же протеолитические ферменты, которые вызывают его гидролиз, но путем обратимости химической реакции, не подтвердились. Оказалось, что синтетические и катаболические реакции протекают не только различными путями, но даже в разных субклеточных фракциях. Не подтвердилась также гипотеза предварительного синтеза коротких пептидов и их последующее объединение в единую полипептидную цепь. Более правдоподобным оказалось мнение, что для синтеза белка требуются источник метаболической энергии, наличие активированных свободных аминокислот и нескольких видов нуклеиновых кислот.

В наши современные представления о механизме синтеза белка несомненный вклад внесли биохимики нашей страны. Так, в лаборатории А. Е. Браунштейна было впервые указано на участие АТФ в синтезе квазипептидных связей (на примерах гиппуровой кислоты, глутамина, глутатиона и ацетанилида). В. Н. Ореховичем еше в 50-е годы было показано, что транспорт аминоацильных или пептидильных группировок на ЫНг-группу аминокислот может осуществляться не только с амидной или пептидной, но и со сложноэфирной связи. Как будет показано ниже, именно этот механизм лежит в основе реакции транспептидирования в 50S рибосоме в стадии элонгации синтеза белка.

Значительно позже были получены неоспоримые доказательства, что в синтезе белка, протекающем в основном в цитоплазме, решающую роль играют нуклеиновые кислоты и, в частности, ДНК. После того как было установлено, что ДНК является носителем и хранителем наследственной информации, был поставлен вопрос о том, каким образом эта генетическая информация, записанная (зашифрованная) в химической структуре ДНК, трансформируется в фенотипические признаки и функциональные свойства живых организмов, передающиеся по наследству. В настоящее время можно дать однозначный ответ на этот вопрос: генетическая информация программирует синтез специфических белков, определяющих в свою очередь специфичность структуры и функции клеток, органов и целостного организма (рис. 110).

Значительный вклад в современные представления о месте, факторах и механизме синтеза белка внесли исследования Касперсона, Хогленда, Берга, Замечника, Очоа, Ниренберга, Гурвица, Вейса и советских биохимиков А. А. Баева, А. Н. Белозерского, А. С. Спирина и др.

Не останавливаясь на всех исторических аспектах развития этой гигантской проблемы следует все же указать, что еще в 40-х годах было установлено, что ДНК локализована в ядре клетки, в то время как синтез белка протекает главным образом в микросомах цитоплазмы. Первые экспериментальные доказательства о необходимости нуклеиновых кислот для синтеза белка были получены в лаборатории Касперсона. Было показано также, что присутствующие в цитоплазме рибонукленновые кислоты контролируют синтез цитоплазматических белков. Таким образом, уже тогда вырисовывалась картина тесной связи между ДНК, локализованной в ядре, и синтезом белка, протекающим в цитоплазме и регулирующимся рибонуклеиновыми кислотами, которые были открыты как в цитоплазме, так и в ядре. На основании этих чисто морфологических данных было сделано заключение, полностью подтвержденное в настоящее время, что биосинтез белка, хотя непосредственно регулируется рибонуклеиновыми кислотами, опосредованно связан с контролирующим влиянием ДНК ядра, и что РНК сначала синтезируется в ядре, затем поступает в цитоплазму, где выполняет роль матрицы в синтезе белка. Полученные значительно позже экспериментальные данные подтвердили гипотезу о том, что основной функцией нуклеиновых кислот является не только хранение генетической информации, но и реализация этой информации путем программирования синтеза специфических белков.

Однако в этой цепи связи ДНК->РНК->Белок недоставало сведений о том, каким образом происходят расшифровка наследственной информации и синтез специфических белков, определяющих многообразие признаков живых существ и функций. В настоящее время наметились основные пути передачи наследственной информации, включающие репликацию, т. е. синтез ДНК на матрице ДНК при участии ДНК-репликазы (подробно рассмотрена выше), транскрипцию, т.е. перевод языка и типа строения ДНК на молекулу РНК; в сущности этот последний биологический процесс сводится к синтезу мРНК на матрице ДНК при участии ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Многие тонкие механизмы репликации и транскрипции окончательно не установлены, и в этой весьма бурно развивающейся области исследования часто меняются наши представления, кажущиеся окончательно установленными. Поэтому вполне допустимо предположение, что ко времени выхода в свет данной книги ряд ее положений, касаюшихся проблем синтеза белка, как и других подробно излагаемых ниже, может оказаться неточным и неполным. 1 Получены экспериментальные доказательства наличия ДНК также в митохондриях (около 1-2% от суммарной ДНК клеток). Она не гомологична и не комплементарна ядерной ДНК. Предполагается, что ДНК кодирует синтез части структурных белков, самих митохондрий (см. ниже).

ТРАНСЛЯЦИЯ И ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К СИНТЕЗУ БЕЛКА В БЕСКЛЕТОЧНОИ СИСТЕМЕ

Прямое отношение к механизмам передачи наследственной информации, как теперь окончательно установлено, имеет процесс трансляции, означающий перевод "четырехбуквенного языка нуклеиновых кислот на двадцатибуквенную речь белков". Другими словами, трансляция сводится к синтезу белка в рибосомах; в этом синтезе последовательность расположения нуклеотидов в мРНК, которая выполняет, кроме того, матричную функцию, определяет первичную структуру белкa, т. е. определенную последовательность расположения отдельных аминокислот в молекуле синтезируемого белка.

Прежде всего остановимся на анализе тех условий, которые абсолютно необходимы для осуществления синтеза белка в бесклеточной системе, и лишь потом рассмотрим современные представления о механизме этого синтеза. В классических исследованиях Замечника и сотр. (50-е годы) при использовании меченых аминокислот было впервые точно установлено, что местом синтеза белка являются рибосомы. При определении радиоактивности белков в различных субклеточных фракциях печени, полученных методом дифференциального центрифугирования через различные промежутки времени, было показано, что метка в первую очередь появляется во фракции микросом и лишь затем в других субклеточных образованиях. После установления места включения радиоактивной метки следующим шагом было выяснение участия других субклеточных фракций и низкомолекулярных клеточных компонентов в синтезе белка. При инкубации фракции микросом печени крыс с радиоактивной аминокислотой включение ¹⁴С-лизина в белки рибосом наблюдалось при наличии в системе, помимо фракции микросом, еще некоторых растворимых компонентов цитоплазмы, источника энергии в форме АТФ (или другой АТФ-генерирующей системы), а также ГТФ.

Вся последующая и весьма интенсивная работа была направлена на поиск других, кроме рибосом, компонентов белоксинтезируюшей системы.

Белоксинтезирующая система включает: набор всех 20 аминокислот, входящих в состав молекулы белка; минимум 20 разных тРНК, обладающих специфичностью к определенному ферменту и аминокислоте; набор минимум 20 различных ферментов - аминоацил-тРНК-синтетаз, также обладающих двойной специфичностью к какой-либо определенной аминокислоте и одной тРНК; рибосомы (точнее полисомы: состоящие из 4-12 монорибосом с присоединенной к ним матричной мРНК); АТФ и АТФ-генерирующую систему ферментов; ГТФ, принимающую специфическое участие в инициации и элонгации синтеза белка в рибосомах; ионы Mg²⁺ от 0,005 до 0,008 М; мРНК в качестве главного компонента системы, несущей информацию о белке, синтезирующемся в рибосоме; наконец, белковые факторы, участвующие в синтезе на разных уровнях трансляции. (Здесь будут представлены сведения, имевшиеся в литературе к августу 1978 г. Разумеется, этот "список" участников белкового синтеза является неполным и будет меняться в соответствии с прогрессом науки.)

Рассмотрим теперь более подробно структуру и функцию главных компонентов белоксинтезирующей системы.

РИБОСОМЫ

Живые организмы, как известно, в зависимости от структуры клеток делятся на две группы: прокариоты и эукариоты. Первые не содержат мембранно-ограниченного ядра и митохондрий или хлоропластов; они представлены главным образом микроорганизмами. Эукариотические клетки, напротив, содержат ядра с мембранами, а также митохондрии (и в ряде случаев хлоропласты); последние представлены клетками животных и растений, включая грибы.

Оба этих типа клеток содержат рибосомы, причем рибосомы эукариотов (клетки животных) примерно в 2 раза больше рибосом прокариотов (бактерий). Обычно рибосомы характеризуют по скорости их седиментации в центрифужном поле, которая количественно выражается коэффициентом седиментации, или величиной S. Величина S зависит не только от размера частиц, но и от формы и плотности, так что она не пропорциональна размеру. Число рибосом в микробной клетке примерно равно 10⁴, у эукариотов - около 10⁵. Величина S для рибосом прокариотов составляет 70S, а у эукариотов - 80S, что почти в 2 раза по размерам больше первых.

Химически рибосомы представляют собой нуклеопротеиды, состоящие только из РНК и белка, причем 80S рибосомы содержат примерно равное количество каждого из них, а у 70S рибосом соотношение РНК и белка составляет 2:1. Чтобы отличить РНК рибосом от транспортных и информационных, их принято называть рибосомными и обозначать рРНК. Как 80S, так и 70S рибосомы состоят из двух субчастиц; это можно показать при помощи электронной микроскопии или путем обработки рибосом растворами, содержащими низкие концентрации Mg²⁺. При этих условиях рибосомы диссоциируют на свои субчастицы; последние могут быть отделены друг от друга на ультрацентрифуге. Одна из субчастиц по размерам в 2 раза превышает размер второй; так, у 70S рибосом величины S для субчастиц равны 50S и 30S, у 80S рибосом - соответственно 60S и 40S. Укажем также, что у Е. coli большая и малая субчастицы содержат 34 и 21 белок соответственно и, кроме того, две молекулы рРНК с коэффициентами седиментации 23S и 5S в большой и одну молекулу рРНК (16S) в малой субчастице. Субчастицы рибосом клеток эукариотов построены более сложно; известно, что большая субчастица (60S) содержат 28S, 5,8S и 5S рибосомные РНК, а малая (40S) содержит 18S рРНК и около 70 разных белков. К середине 1978 г. выяснена первичная структура более 30 белков рибосом Е. coli в лаборатории Виттмана и нескольких белков в лаборатории Ю. А. Овчинникова в Институт белка.

Относительно происхождения рибосом имеющиеся данные свидетельствуют о том, что рРНК происходит из общего предшественника всех клеточных РНК, в свою очередь синтезирующейся на матрице ДНК в ядре; рибосомные белки имеют цитоплазматическое происхождение, затем они транспортируются в ядрышки, где и происходит спонтанное образование рибосомных субчастиц путем объединения белков с соответствующими рРНК2. Объединенные субчастицы вместе или врозь транспортируются через поры ядерной мембраны обратно в цитоплазму, где ряд рибосом вместе с мРНК образуют полисомы (см. ниже). Имеющиеся данные по химическому составу рибосом суммированы в виде схемы (рис. 111).

Аминоацил-тРНК-синтетазы

Имеются веские экспериментальные доказательства существования в любых клетках живых организмов специфических ферментов, катализирующих активирование аминокислот и связывание последних с определенными тРНК. Все эти ферменты выделены в чистом виде из Е. coli. Молекулярная масса почти всех синтетаз равна 100 000, за исключением фенилаланил-ацил-тРНК-синтетазы (180 000). Все они оказались чувствительными к реагентам на SH-группы и нуждаются в присутствии Mg²⁺. Ферменты обладают абсолютной специфичностью действия, поскольку они узнают только одну какую-либо аминокислоту или одну тРНК; это обстоятельство чрезвычайно важно, поскольку в белковом синтезе в дальнейшем "узнавание" аминоацил-тРНК основано не на природе аминокислоты, а на химической природе антикодона тРНК. Считается, что в молекуле каждой аминоацил-тРНК-cинтетазы имеется по крайней мере три центра связывания: для аминокислоты, тРНК и АТФ; ферменты весьма чувствительны также к аналогам аминокислот, которые ингибируют активирование соответствующих аминокислот. Ферменты получили также наименование АРС-аз и кодаз (В. А. Энгельгардт), чтобы подчеркнуть их роль в реализации генетического кода.

ТРАНСПОРТНЫЕ РНК

В лаборатории Хогленда было показано, что если проинкубировать ¹⁴С-аминокислоту с растворимой фракцией цитоплазмы в присутствии АТФ и затем добавить трихлоруксусную кислоту, то в образовавшемся белковом осадке метка не открывается. Было сделано заключение, что меченая аминокислота не включается в белковую молекулу. Метка оказалась связанной ковалентно с РНК, содержащейся в безбелковом фильтрате. Автор показал, что РНК, к которой присоединяется меченая аминокислота, имеет небольшую молекулярную массу и сосредоточена в растворимой фракции, поэтому ее назвали растворимой (от англ. soluble - sRNA). Сейчас принято обозначать ее тРНК. На долю тРНК приходится около 10-15% общего количества клеточной РНК. К настоящему времени открыто более 60 различных тРНК. Для каждой аминокислоты в клетке имеется по крайней мере одна специфическая РНК (для ряда аминокислот открыто более одной, в частности для серина - 5 разных, для лизина и глицина - по 4 разных тРНК, хотя и в этом случае каждая тРНК связана со специфической аминоацил-тРНК-синтетазой. Молекулярная масса большинства тРНК колеблется от 24 000 до 29 000. Они содержат от 75 до 85 нуклеотидов. Аминокислоты присоединяются к свободной 3'-ОН-группе концевого мононуклеотида, представленного во всех тРНК одной и той же адениловой кислотой с образованием эфирной связи. Следует отметить, что все тРНК содержат не только одинаковый концевой нуклеотид, но и одинаковый триплет - Ц-Ц-А-3'-ОН.

Установлена первичная структура (см. Химия нуклеиновых кислот) почти всех из 60 открытых тРНК; знание последовательности нуклеотидов и, следовательно, состава тРНК дало в руки исследователей много ценных сведений о биологической роли отдельных компонентов тРНК. Общим оказалась также нативная конформация (в частности, трехмерная структура, установленная методом рентгеноструктурного анализа), названная первоначально конформацией клеверного листа; на самом деле эта конформация имеет неправильную, Г-образную, форму.

Определение структуры тРНК позволило выявить так называемую антикодоновую петлю (рис. 112), несущую триплет, названный антикодоном, который оказался специфичным и комплементарным к соответствующему кодону матричной РНК.

Таким образом, тРНК, помимо связывания определенной аминокислоты, осуществляемого ковалентной связью, обладают также специфическим триплетом (антикодоном), который соединяется комплементарно с кодоном мРНК посредством водородных связей; интересным оказался тот факт, что в состав антикодона иногда входит какое-либо минорное основание. Подсчитано, что в состав тРНК входит до 10-15% минорных оснований (см. Химия сложных белков). Функции минорных оснований, вероятнее всего, сводятся к обеспечению нативной структуры и резистентности к гидролизующему действию РНК-аз.

Тщательный анализ нуклеотидной последовательности разных тРНК показал, что все они содержат одинаковый 5'концевой нуклеотид - гуаниловую кислоту со свободной 5'-фосфатной группой. Одинаковыми оказались также последовательности триплета: дигидроуридил-гуанозил-аденилового в дигидроуридиловой петле и пентануклеотида в псевдоуридиловой петле.

МАТРИЧНАЯ РНК

Выше было указано на необходимость предобразованной молекулы РНК для правильной расстановки аминокислот вдоль полипептидной цепи. Было высказано предположение, что такой молекулой может служить рРНК. О такой возможности как будто бы говорили опыты по заражению клеток Е. coli ДНК фага. Оказалось, что немедленно после заражения синтез нормальных клеточных ДНК прекращался, и начинался интенсивный синтез фаговой ДНК. Более того, весь белоксинтезирующий аппарат клеток перестраивался на синтез только фаговых белков. Но поскольку состав синтезированных фаговых белков отличался от состава белков бактерий, было высказано предположение, что при заражении фагом, очевидно, меняется последовательность оснований в РНК. Однако это не подтвердилось. Было высказано мнение, что предобразованная РНК, необходимая для изменения типа синтезируемого белка, должна обладать высокой скоростью обновления своего состава, т. е. молекула такой РНК должна синтезироваться и распадаться с такой скоростью, чтобы обеспечить высокую обновляемость нуклеотидного состава. Фактически рибосомная РНК оказалась метаболически весьма стабильной. По этим причинам, т. е. по стабильности структуры и обмена, становилось очевидным, что рРНК не может служить в качестве шаблона.

В ряде лабораторий (в частности, в лаборатории Бреннера) были получены данные о существовании в клетках в соединении с рибосомами короткоживущей РНК. Он назвал ее мРНК, полагая, что ее роль заключается в переносе информации от ДНК в ядре (где она синтезируется под действием ДНК-зависимой РНК-полимеразы) до цитоплазмы, где она соединяется с рибосомами и служит лентой, на которой происходит синтез белка. Это блестящая гипотеза затем экспериментально была доказана в лаборатории Ниренберга. Автор изучал влияние различных фракций РНК на способность рибосом, выделенных из Е. coli, к синтезу белка. Некоторые фракции РНК стимулируют включение ¹⁴С-аминокислот в белки. Добавление синтетического полинуклеотида и, в частности полиуридилата (поли-У) в белоксинтезирующую систему привело к включению в синтезирующуюся белковую молекулу единственной аминокислоты - фенилаланина. Поли-У вызывал синтез в бесклеточной системе необычного полипептида полифенилаланина. Значение этих данных было ясно: специфический полинуклеотид, добавленный к препаратам рибосом (включая известные к тому времени факторы белкового синтеза и источники энергии), вызывал синтез специфического полипептида. Таким образом, эти опыты открыли прямую дорогу для экспериментальной расшифровки кода, при помощи которого информация от РНК передается на синтезированный белок. Последовательность нуклеотидов РНК реализуется в специфической последовательности аминокислот синтезируемой полипептидной цепи. Опыты Ниренберга свидетельствуют также о том, что не рибосома и не рРНК являются матрицей, на которой синтезируются специфические белки, а эту роль выполняют поступающие в рибосому извне матричные РНК.

Итак, ДНК передает информацию на РНК, которая синтезируется в ядре и затем поступает в цитоплазму. Здесь РНК выполняет матричную функцию для синтеза специфической белковой молекулы.

ПРИРОДА ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОДА

Одним из наиболее интригующих головоломок молекулярной биологии качала 70-х годов было выяснение вопроса о том, каким образом четырехбуквенный "язык" ДНК, содержащей всего четыре разных азотистых основания (А, Г, Ц, Т), переводится на двадцатибуквенную "речь" белков через образования мРНК. Вопрос сводится к тому, из чего состоит этот таинственный код. Вероятнее всего, он заключается в определенной последовательности расположения нуклеотидов в молекуле ДНК. Вопросы о том, какие нуклеотиды ответственны за включение определенной аминокислоты в белковую молекулу и какое количество нуклеотидов определяет это включение, оставались нерешенными до 1961 г. Теоретический разбор показал, что код не может состоять из одного нуклеотида, поскольку в этом случае только 4 аминокислоты могут кодироваться. Но код не может быть и дуплетным, т. е. комбинация двух нуклеотидов из четырехбуквенного "алфавита" не может охватить всех аминокислот, так как подобных комбинаций теоретически возможно только 16 (4²=16), а в состав белка входит 20 аминокислот. Для кодирования всех аминокислот белковой молекулы было бы достаточно взять триплетный код, когда число возможных комбинаций составит 64 (4³=64).

Из приведенных выше данных Ниренберга становится очевидным, что поли-У, т. е. РНК, содержащая остатки только одного уридилового мононуклеотида в системе синтеза белка, способствует синтезу белка, построенного из остатков одной аминокислоты - фенилаланина. На этом основании был сделан вывод, что кодоном для включения фенилаланина в белковую молекулу может служить триплет, состоящий из 3 уридиловых нуклеотидов, - УУУ. Вскоре после этих исследований было показано, что синтетическая матричная полицитидиловая кислота (поли-Ц) кодирует образование полипролина и матричная полиадениловая кислота (поли-А) - полилизина; соответствующие триплеты - ЦЦЦ и ААА- действительно оказались триплетами (названными кодонами) для кодирования пролина и лизина.

Вслед за этими данными Ниренберг, Очоа и Хорана, пользуясь искусственно синтезированными мРНК, представили доказательства не только состава, но и последовательности триплетов всех кодонов, ответственных за включение каждой из 20 аминокислот белковой молекулы. Полный кодовый "словарь", т. е. все мыслимые 64 кодона, представлены в табл.

Как видно, генетический код для аминокислот является вырожденным. Это означает, что подавляющее большинство аминокислот кодируется несколькими кодонами; за исключением метионина и триптофана, по существу все остальные аминокислоты имеют более одного специфического кодона. Вырожденность кода оказывается неодинаковой для разных аминокислот. Так, если для серина и лейцина имеется по 6 кодовых слова, то ряд других аминокислот, в частности глутаминовая кислота, гистидин и тирозин, имеют по 2 кодона, а триптофан - только один. Следует отметить, что вырожденность чаще всего касается только третьего нуклеотида, в то время как почти для всех аминокислот первые два нуклеотида являются общими. Вполне допустимо поэтому предположение, что последовательность первых двух нуклеотидов определяет в основном специфичность каждого кодона, в то время как третий нуклеотид, очевидно, менее существенен.

Имеются доказательства, что вырожденность генетического кода имеет несомненный биологический смысл, обеспечивая организму ряд преимуществ. В частности, она способствует "совершенствованию" генома, так как в процессе мутации могут наступать различные аминокислотные замены, наиболее ценные из которых отбираются в процессе эволюции.

Другой отличительной особенностью генетического кода является отсутствие "знаков препинания", т. е. сигналов, указывающих на конец одного кодона и начало другого. Другими словами, код является линейным, однонаправленным и не прерывающимся: АЦГУЦГАЦЦ. Это свойство генетического кода обеспечивает синтез в высшей степени упорядоченной последовательности молекулы белков. Во всех других случаях последовательность нуклеотидов в кодонах нарушается, и это приводит к синтезу "бессмысленной" полипептидной цепи с измененной структурой. Наконец, следует указать еще на одну особенность кода, заключающуюся в его универсальности для всех живых организмов: от Е. coli, растений, амфибий и др. до человека.

Из табл. видно, кроме того, что среди 64 мыслимых кодонов 61 имеет смысл, т. е. кодирует определенную аминокислоту. В то же время три кодона, а именно, УАГ, УАА, УГА, оказываются "бессмысленными", так как они не кодируют аминокислот. Однако эти кодоны не лишены смысла, поскольку, как мы увидим ниже, они выполняют важную функцию в синтезе белка в рибосомах (функцию окончания, терминации синтеза).

При исследовании генетического кода в опытах in vivo были также получены доказательства универсальности кода. Об этом же говорят данные последовательности аминокислот в полипептидных цепях гемоглобинов, полученных от пациентов из многих стран мира.

Продолжение: Этапы синтеза белка