IX. Иммунологические механизмы клеточного гомеостаза

Предыдущая: Коррекция иммунного ответа синтетическими полиэлектролитами

Хотя после того, как Луи Пастер впервые научно обосновал основной принцип создания вакцин, прошло почти 100 лет, современные вакцинирующие препараты и методы вакцинации по своей сути мало отличаются от пастеровских. Многочисленные осложнения вакцинаций, а также неэффективность вакцин против ряда инфекционных болезней диктуют необходимость поиска новых подходов и новых принципов вакцинации. Это не значит, что пастеровский принцип себя исчерпал, но необходимы более эффективные и более перспективные принципы. Имеются ли в настоящее время какие-либо перспективные пути к решению проблемы создания вакцин принципиально нового типа?

Весьма интересный оригинальный подход разрабатывает М. Sela (1974, 1977). Он предлагает искусственно синтезировать уникальные специфические антигенные детерминанты, каждая из которых характерна для того или иного инфекционного агента. В последующем можно будет сконструировать макромолекулу, одновременно несущую несколько таких фрагментов. Предполагается, что эти макромолекулы будут представлять собой синтетический аналог поливалентной вакцины, иммунизирующей сразу против нескольких инфекций. Реально ли это? Очевидно, что этот подход возможен в отношении антигенов, иммунизирующая способность которых сохраняется при использовании убитых вакцин или их ингредиентов. Действительно, защита, полученная при иммунизации против возбудителей различных болезней, связана с иммунным ответом против уникальных специфических антигенных детерминант, присутствующих в доступной форме на поверхности, мембране или клетке возбудителя, т. е. вируса (Sela М., 1974). Другими словами, гуморальный и клеточный иммунный ответы развиваются против уникальных молекулярных структур, но не против вируса в целом. Такие детерминанты могут быть полисахаридной или полипептидной природы. В определении антигенной специфичности этих детерминант важнейшим фактором является стерическая конформация (трехмерная структура молекулы).

Как правило, антитела против нативных белков реагируют с теми же белками денатурации очень слабо и, наоборот, антитела к денатурированным белкам обычно не реагируют перекрестно с теми же белками в нативном состоянии (Sela М. et al., 1967). Это связано с тем, что антигенные детерминанты нативного белка отражают преимущественно структуру молекулы. По мнению М. Sela, антивирусные антитела часто направлены против детерминант белковой оболочки вируса, и они, возможно, по аналогии с другими нативными белками имеют конформационно-зависимые детерминанты, определяемые нативной структурой белков оболочки.

При исследовании роли конформации в антигенности была показана перекрестная иммунологическая реагируемость как на гуморальном, так и на клеточном уровне между коллагеноподобным периодическим полимером трипептида Про-Глу-Про и коллагеном нескольких видов (Borek F. et al., 1969). В свете этих данных было весьма важным выяснить, насколько вероятно индуцировать антитела, специфически направленные к уникальной ограниченной области в макромолекуле и в то же время к нативному белку. Свои исследования в этом плане М. Sela и соавт. начали с изящных молекулярно-иммунологических экспериментов (Arnon R., Sela М., 1969; Arnon R. et al., 1971). Из лизоцима белка куриного яйца (удобный для исследования антиген с известной первичной и пространственной структурой) комбинацией ограниченного протеолиза и мягкой редукции был выделен иммунологически активный фрагмент молекулы. Этот фрагмент - так называемая петля - состоит из 24 остатков (с 60-го по 83-й) аминокислотных последовательностей лизоцима и содержит одну межцепочную дисульфидную связь. Антитела, специфические к этой области, избирательно изолируются из антилизоцимной сыворотки адсорбцией на соответствующем "петлевом" иммуноадсорбенте. Антипетлевые антитела, изолированные таким образом, демонстрируют, как ожидалось, меньшую гетерогенность, чем антитела против тотального лизоцима. Антитела такой же специфичности могут быть приготовлены альтернативным, более интересным методом (Arnon R. et al., 1971). Изолированный "петлевой" пептид прикрепили к синтетическому макромолекулярному носителю (многоцепочечному поли-DL-аланину). Иммунизация этим конъюгатом кроликов и коз привела к выработке антител, реагирующих с лизоцимом.

Более детальные специфические исследования показали, что эти антитела направлены против конформационно-зависимых детерминант. Это свидетельствует как об их способности распознавать структуру "петли" в нативном лизоциме, так и о способности к различию между "петлей" и его открытой пептидной цепью (Sela М., 1974), т. е. антипетлевые антитела взаимодействуют с нативным лизоцимом, распознавая структуру "петли". Поскольку аминокислотная последовательность области "петли" была известной, аналогичный "петле"-подобный пептидный фрагмент приготовили химическим синтезом (Arnon R. et al., 1971). Полученный синтетический продукт прикрепили к макромолекулярному синтетическому носителю - многоцепочечному поли-DL-aланину. Иммунизация этим конъюгатом в полном адъюванте Фрейнда кроликов и коз привела к образованию антител, ничем не отличающихся от антител, вырабатываемых при иммунизации конъюгатом природной лизоцимной "петли". Этот пример демонстрирует возможность использования полностью синтетической молекулы для выработки антител, реагирующих с нативным белком. Вместе с тем эти антитела направлены против уникальной конформационно-зависимой ограниченной области белка.

М. Sela (1974) высказал предположение, что такие же результаты могут быть получены с другими белками, аминокислотная последовательность которых известна, например при приготовлении синтетических молекул, которые будут стимулировать иммунный ответ против определенных оболочечных белков вирусов. Успех будет зависеть от прогресса в изучении первичной и третичной структуры белковых оболочек различных вирусов. Действительно, недавно была показана возможность приготовления полностью синтетической макромолекулы, которая вызывает продукцию антител, способных инактивировать вирус (колифаг MS-2). H.Langbeheim и соавт. (1976) синтезировали фрагмент белковой оболочки этого РНК-содержащего вируса, который прикрепили к разветвленному поли-DL-аланину. Полученный конъюгант при инъекции кроликам в полном адъюванте Фрейнда вызывает образование антител с фагонейтрализующей активностью. Такие же антитела образуются при иммунизации интактным колифагом, выделенным из его оболочки белком или иммуногенным пептидом, полученным в результате расщепления цианогенбромидом.

Фагонейтрализующая способность антител, стимулированных синтетическим антигеном, высокоспецифична, так как полностью ингибируется белком оболочки фага или выделенным из него активным пептидом. Наряду с этим синтетический антиген ингибировал инактивацию фага антисывороткой, полученной иммунизацией фагом или его иммуногенным пептидом.

Для развития эффективного иммунного ответа ко многим вакцинам необходимо добавление адъювантов, которые часто вызывают нежелательные побочные осложнения (Воробьев А. А., Васильев Н. Н., 1969). Предполагают, что синтетические вакцины будут содержать "встроенную" адъювантность и могут оказаться менее опасными и лучшего качества при использовании у человека. В этом плане представляют интерес следующие работы. Введение N-лаурилглюкозаминовых остатков в синтетические макромолекулы значительно увеличивает их иммуногенность (Rude Е. et al., 1971). Показано, что химическое прикрепление низкомолекулярного пептидогликана к синтетическому антигену обеспечивает продукцию антител при иммунизации этим конъюгатом как в неполном адъюванте Фрейнда, так и в водном растворе (Sela М., 1977).

Важным преимуществом принципа М. Sela является то, что синтетические вакцины, построенные по предлагаемому им методу, не будут содержать многих посторонних антигенных детерминант вирусов или посторонних белков, контампнирующих все без исключения современные вакцинные препараты. Это позволит избежать многих нежелательных побочных реакций вакцинации. Другое преимущество этого принципа - конструирование вакцинирующих молекул в зависимости от конкретной необходимости. Предполагается прикрепление 5-10 детерминантных характеристик различных вирусов на одну синтетическую макромолекулу и использование ее для иммунизации таким образом, чтобы все детерминанты замещали современные вакцины очень небольшим числом адекватно сконструированных синтетических макромолекул. Правда, при этом необходимо учитывать феномен внутримолекулярной антигенной конкуренции.

Таким образом, методами молекулярной инженерии, по-видимому, могут быть построены разнообразные варианты поливалентных синтетических вакцин. По словам самого М. Sela, это "звучит сегодня, как сон". Станет ли сон реальностью?

К сожалению, решение вопроса о синтезе отдельных молекулярных структур (детерминант) антигенов и их сборка на одной макромолекуле - еще неокончательное решение проблемы создания эффективных синтетических вакцин. Неизвестно, будет ли успешным этот принцип при изготовлении синтетических вакцин против всех микробов и вирусов. Если вспомнить, что выделенные из микроорганизмов антигены не иммунизируют так же эффективно, как аттенуированные вирусы или микробы, то становится ясным, что такие вакцины не будут эффективными и в случаях их искусственной сборки. Кроме того, против ряда инфекций не удается создать вакцины и из живых аттенуированных микроорганизмов. Выше уже говорилось, что если у какого-либо индивидуума отсутствует ген, обеспечивающий способность к иммунному ответу на данный антиген, то при вакцинации антитела вырабатываться не будут. Поэтому синтетические вакцины будущего должны обладать свойством стимулировать иммунный ответ к разным антигенам у любого индивидуума, даже генетически низкореагирующего или нереагирующего. Мы вновь возвращаемся к ранее сформулированной необходимости изыскания путей превращения низкореагирующего генотипа в высокореагирующий. Это главная проблема фенотипической коррекции иммунного ответа.

К созданию синтетических вакцин М. Sela идет по пути природы. В докладе на III Международном конгрессе иммунологов он говорил: "Мы должны копировать природу не в целом, а частями". Методами молекулярной инженерии предлагается копирование природных молекулярных структур. Но если вакцины из природных антигенов отнюдь не всегда эффективны, стоит ли идти только этим путем? Нет ли других подходов к этой проблеме?

В последние годы в нашей лаборатории наметился иной подход к проблеме синтетических вакцин. Суть его заключается в том, что искусственная вакцина должна нести на своих макромолекулах не только детерминантные фрагменты антигенов, но одновременно и такую структуру, которая обеспечивала бы продукцию антител к разнообразным антигенам, независимо от генетического фона иммунизируемой особи. Этот принцип вырос и сформулировался из следующих исследований. Выше было показано, что синтетические полиэлектролиты ПВП, ПМВП и ПАК активно влияют на иммуногенез. Введение этих "неприродных" полимеров животным усиливает отдельные этапы иммунопоэза, что обеспечивает сильное повышение иммунного ответа к разным антигенам. Очень важно то, что с помощью полиэлектролитов удается обеспечить высокий ответ у генетически низкореагирующих особей.

Замещая функцию Т-помощников и содействуя Т-В-взаимодействию, эти полиэлектролиты как бы обеспечивают "обход" генетического контроля для примененного вместе с ними антигена. Поэтому вполне естественно возникла мысль, что если чистый гаптен или слабый антиген присоединить к макромолекуле полиэлектролита, то такая "комбинированная" молекула должна идеально сочетать в себе как антигенную специфичность, так и иммуностимулирующие свойства, даже при наличии Ir-генов низкого ответа.

Использованные нами синтетические полиэлектролиты аналогов в природе не имеют. Они не являются искусственным воспроизведением белковой молекулы или ее части и не укладываются в принцип "копирования природы". Разница в строении макромолекул искусственных полиэлектролитов и синтетических пептидов, например поли-l-лизина, заключается в том, что полиэлектролиты представляют собой относительно простые макромолекулы с углеродными последовательностями -С-С-С-, а пептидный носитель имеет последовательность N-С-С-N. В свете этих данных была выдвинута идея создания искусственных антигенов принципиально нового типа на основе чисто синтетических "неприродных" полиэлектролитов (Петров Р. В. и др., 1977а; Петров Р. В., Хаитов Р. М., 1978). Было предпринято изучение антигенных свойств соединений, в которых известные гаптены введены в чисто синтетическую "неприродную" макромолекулу (Петров Р. В. и др., 1977а). В качестве высокомолекулярных носителей (матриц), обусловливающих проявление иммуногенных свойств гаптена, были выбраны ПМВП и ПВП. Продуктом их взаимодействия является пикрат. Установлена идентичность полученного вещества пикрату, приготовленному из ПМВП и пикриновой кислоты.

Для определения иммуногенных свойств синтезированных антигенов мышей иммунизировали различными дозами модифицированного ПМВП или ПВП и определяли продукцию АОК и РОК к нагруженным ТНБС эритроцитам барана в селезенке животных и титры гемагглютининов к ним в периферической крови (Петров Р. В. и др., 1976). Оказалось, что пикрат ПМВП обладает ярко выраженными антигенными свойствами. Показано, что число антителопродуцентов против ТНФ, накапливающихся в селезенке мышей, иммунизированных пикратом ПМВП, изменяется в зависимости от используемой дозы; при увеличении дозы с 5 до 500 мкг количество АОК в селезенке возрастает от 48 до 3520. Введение мышам только ПМВП, пикриновой кислоты или их смеси не дает превышения числа антителопродуцентов в селезенке над фоновым уровнем.

Количество РОК в селезенке мышей при введении различных доз пикрата также изменяется. Наибольшее их число (в 4 раза больше фоновых значений) обнаружено у животных, получавших по 500 мкг вещества. Исследование уровня антител к ТНФ в сыворотке животных показало, что максимальные титры регистрируются при введении 500 мкг пикрата ПМВП. Пикрат ПВП, полученный непосредственно из ПВП и пикриновой кислоты, как и следовало ожидать, также обладал антигенными свойствами и индуцировал формирование АОК и синтез антител к ТНФ. Для оценки анафилактогенности пикрата ПМВП была поставлена; реакция активной анафилаксии. Морских свинок иммунизировали внутрикожно в дозах 20, 30 и 60 мкг на свинку пикрата ПМВП. Через 14 сут после иммунизации животные получали внутривенно разрешающую инъекцию антигена (1000 мкг). У свинок, иммунизированных в дозе 60 мкг, наблюдались признаки классического анафилактического шока. Таким образом, установлена выработка антител в ответ на иммунизацию мышей и морских свинок производными тринитробензола, включенными в такие относительно простые макромолекулы, какими являются ПМВП и ПВП.

Следует отметить, что иммунизация животных гаптенами на белковых носителях (бычий сывороточный альбумин, глобулин и т. д.) приводит к развитию выраженного иммунного ответа только при совместной инъекции с адъювантами, стимулирующими иммунные реакции, например полным стимулятором Фрейнда и т. п. Введение же пикрата ПМВП или ПВП обеспечивает развитие иммунного ответа в отсутствие адъювантов. Кроме того, опыты на В-мышах показали, что пикрат ПМВП или ПВП является тимуснезависимым антигеном (Петров Р. В., Хаитов Р. М., 1978). В селезенке В-мышей, иммунизированных пикратами полиоснований, формировалось такое же число антителопродуцентов к тринитрофенилу, как и у интактных иммунных мышей. Следовательно, введение гаптенных группировок в макромолекулы поликатионов позволяет искусственно конструировать тимуснезависимые антигены. В последующей работе нами совместно с В. А. Кабановым и соавт. (1978) был приготовлен комплекс бычьего сывороточного альбумина (БСА) с поликатионом. Ожидалось, что такой комплекс вызовет повышенный иммунный ответ к БСА. В качестве полимера-комплексообразователя был выбран сополимер (СП) 4-винил-N-этилпиридин- и 4-винил-N-цетилперидин бромидов

где m/(m+n) · 100= 10%. Этот выбор определяется тем, что представленный на схеме СП в области нейтральных pH потенциально способен комплексовать с БСА как путем образования электростатических солевых связей, так и за счет гидрофобного взаимодействия цетильных радикалов с неполярными участками белковых глобул. Поэтому в данном случае можно было ожидать формирования особенно прочных комплексов белок - полиэлектролит, не диссоциирующих при физиологических значениях ионной силы. Комплексы БСА и СП получали аналогично тому, как описано в работе В. А. Кабанова и соавт. (1977).

Были приготовлены растворы комплекса трех концентраций:

• раствор I - с = 0,61 г/дл (0,35 г/дл СП+0,25 г/дл БСА);
• раствор II - с = 1,22 г/дл (0,72 г/дл СП+0,50 г/дл БСА);
• раствор III - с = 2,44 г/дл (1,44 г/дл СП+1 г/дл БСА).

В дальнейшем эти растворы использовали для иммунизации. В специальных опытах было показано, что комплекс БСА - СП не разрушается при добавлении в раствор низкомолекулярных солей. При концентрации NaCl 0,154 н. он выпадает в осадок, сохраняя неизменным свой состав. Последнее дает основания полагать, что в физиологических средах исследуемый комплекс также не диссоциирует на исходные компоненты. Результаты упомянутых выше физико-химических измерений (Кабанов В. А. и др., 1977) позволяют предположить следующую гипотетическую схему строения частицы комплекса (рис. 61). Обе глобулы БСА в каждой частице комплексов, по-видимому, находятся в контакте друг с другом, обвитые поликатионом-носителем. Некоторые гидрофобные цетильные радикалы поликатиона связаны с гидрофобными участками БСА, другие контактируют друг с другом, стабилизируя структуру в целом. Фрагменты поликатиона, не содержащие цетильных групп, по всей вероятности, частично находятся в виде свободных "петель", "растворенных" в воде, а частично образуют солевые связи с отрицательно заряженными группами на поверхности глобул белка.

Иммуногенные свойства растворов комплекса изучали на мышах линий C57BL/6 и (CBA X C57BL/6)F₁ (Кабанов В. А. и др., 1978). Мышей иммунизировали внутрибрюшинно растворами комплекса, растворами чистого БСА и раствором чистого СП и определяли число IgM-AOK к БСА модифицированным методом Ерне, используя эритроциты барана, нагруженные БСА. Однократная иммунизация чистым БСА в дозе 0,5-2 мг практически не вызывает продукции АОК (рис. 62). Растворы чистого СП также оказались иммунологически неактивными. В противоположность этому иммунизация мышей раствором комплекса БСА-СП приводит к развитию иммунного ответа на БСА, высота которого варьирует в зависимости от дозы использованного комплекса. Максимальное накопление антителопродуцентов при оценке через 5 и 10 дней после введения наблюдается при иммунизации раствором III. Иммунологическая активность комплекса в растворе III оказывается по крайней мере в 50-100 раз выше, чем наблюдаемая при иммунизации раствором чистого БСА.

Оценку специфичности иммунного ответа при иммунизации комплексами проводили с использованием эритроцитов барана, нагруженных либо БСА (БСА-ЭБ), либо овальбумином (ОА-ЭБ). Кроме того, применяли тест ингибирования АОК путем предварительного добавления в агар исследуемого антигена. По-казано, что АОК, накапливающиеся в селезенке мышей, иммунизированных раствором III, выявляются только при использовании в качестве тест-антигена БСА-ЭБ, но не ОА-ЭБ. Причем проявление антителопродуцентов полностью ингибируется добавлением в агар БСА. Следовательно, АОК, выявляемые в селезенке мышей, иммунизированных растворами комплекса, синтезируют и секретируют антитела, специфические по отношению к БСА. Изучение кинетики накопления антителопродуцентов в селезенке мышей, иммунизированных раствором III, показало, что пик иммунного ответа на БСА, наблюдается через 10 сут после иммунизации.

Иммунологические свойства системы БСА-СП нельзя объяснить действием СП как обычного иммуноадъюванта, так как раздельное введение БСА и СП не приводит к столь значительному антителогенезу, как при введении БСА-СП. Более того, введение БСА в комбинации с ПВП, который является сильным полимерным адъювантом, хотя и вызывает стимуляцию продукции АОК, но число их в селезенке оказывается значительно меньшим, чем при иммунизации раствором III. ПВП в условиях опыта не образует прочных комплексов с БСА. Следовательно, повышенной иммунологической активностью обладает именно комплекс БСА-СП, который можно рассматривать как необычайно сильный искусственный антиген - продукт самосборки из белка и синтетического карбоцепного полиэлектролита, каждый из которых в отдельности либо неиммуногенен (СП), либо слабо иммуногенен (БСА).

Таким образом, сделаны первые шаги на пути конструирования синтетических антигенов нового типа. Если антигены различных инфекционных агентов (против которых иммунитет не развивается или проявляется слабо) либо их отдельные детерминанты, присоединенные к макромолекулам полиэлектролитов, будут вызывать эффективную иммунную защиту, наш принцип создания вакцинирующих молекул явится одним из подходов к решению проблемы создания синтетических вакцин будущего. Сейчас трудно предсказать, какой принцип конструирования вакцин в будущем окажется более эффективным - принцип "имитации природы" или поиск "неприродных" молекул с закладываемыми в них искомыми качествами, ясно одно, что такие способы будут найдены.

К оглавлению

Литература [показать]