|
|
Пренатальная диагностика генных болезней
Страница
1
2
3
| всего страниц: 3 |
Общие представления
На долю генных (моногенных) нарушений приходится в общей сложности до 5% всей врожденной патологии. Это так называемый генетический груз
популяции [7]. Из них на собственно моногенные болезни приходится около 1%; 3-3,5% составляют заболевания с выраженной наследственной
предрасположенностью (диабет, атеросклероз, многие онкологические заболевания).
Для ПД, в первую очередь, представляют интерес генные болезни, приводящие к тяжелой, нередко смертельной патологии, в отношении которых
пока отсутствуют или все еще малодоступны методы лекарственной терапии. Из более 6000 заболеваний, известных на сегодняшний день, доля заболеваний,
безусловно заслуживающих ПД, составляет не более 1% [25]. Причем и в этой группе удельный вес различных нозологии существенно варьирует.
Большая часть моногенной патологии, требующей ПД,- такие сравнительно частые и тяжелые болезни, как муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна, синдром
ломкой (фрагильной) Х-хромосомы, гемофилия А, фенилкетонурия, поликистоз почек, атаксия Фридрейха, синдром Верднига-Гоффмана, синдром
Шарко-Мари-Туc. ПД именно этих социально значимых моногенных заболеваний является особенно актуальной.
Впервые пренатальная молекулярная диагностика (ДНК-диагностика) в России проведена в Санкт-Петербурге в 1987 г. женщине высокого риска
рождения ребенка с муковисцидозом [11]. К настоящему времени в стране осуществлено около 1000 ПД моногенных болезней [18], из которых более
500 выполнено в нашем Центре. Это позволило предотвратить рождение 200 детей с тяжелыми моногенными болезнями, в т. ч. с муковисцидозом,
фенилкетонурией, гемофилиями А и В, миодистрофией Дюшенна, синдромом ломкой Х-хромосомы и др. [12]. Список генетических Центров страны, где
проводится ДНК-диагностика наиболее частых моногенных болезней, приведен в табл. 14.4.
Меры повышения эффективности пренатальной диагностики генных болезней
Принимая во внимание высокую точность современных молекулярных методов, их большую чувствительность и, к сожалению, достаточно высокую
себестоимость, необходимо помнить, что эффективность ДНК-диагностики у плода в значительной мере предопределяется соблюдением следующих основных
требований:
- Точностью клинического диагноза у пробанда
[показать] .
Молекулярная диагностика проводится на уровне индивидуальных генов, точнее, на уровне фрагментов ДНК самих генов
или близлежащих ДНК-последовательностей. Отсутствие точного клинического диагноза моногенного заболевания, делает, по сути,
невозможным применение молекулярных методов. К сожалению, несовершенство лабораторных методов, недостаточный опыт клиницистов и
медицинских генетиков, консультирующих семьи высокого риска, нередко ведет к тому, что на ПД направляются женщины, в семьях которых
диагностика ДНК-методами невозможна.
- Своевременным обследованием семьи высокого риска и больного молекулярными методами
[показать] .
Одно и то же моногенное заболевание может быть результатом самых разных мутаций одного и того же гена. Идентификация
таких мутации в каждой семье - необходимое условие успешной ПД. Особенно важно, чтобы идентификация мутаций и молекулярное маркирование
мутантных хромосом были проведены при наличии в семье больного ребенка. Поэтому ДНК-обследование каждой семьи высокого риска должно
осуществляться сразу же после постановки диагноза до наступления следующей беременности. При этом особую диагностическую ценность
представляют препараты ДНК самого больного.
В случае отсутствия в семье больного ребенка и невозможности точно идентифицировать мутации у родителей, ПД молекулярными методами
невозможна.
Своевременное направление семей или образцов крови семей высокого риска в соответствующие центры ДНК-диагностики для выяснения
информативности семьи, т.е. ее пригодности для ДНК-диагностики, - важная функция кабинетов медико-генетического консультирования.
- Правильностью оценки риска рождения больного ребенка
[показать] .
Правильность постановки клинического диагноза предполагает и правильность оценки риска рождения больного ребенка.
Известно, что для аутосомпо-рецессивных заболеваний риск составляет 25%, для аутосомно-доминантных - 50%, для болезней, сцепленных
с полом,- 50% для мальчиков и практически 0% - для девочек.
Особую сложность для оценки риска представляют болезни "экспансии", наследование которых нередко существенно отклоняется от законов
Менделя. К числу таких болезней относятся синдром фрагильной Х-хромосомы, миотоническая дистрофия, хорея Гентингтона, ряд других
нейродегенеративных заболеваний.
При оценке риска особого внимания заслуживают заболевания, для которых велика вероятность гонадного мозаицизма (т.е. мутантные клетки
присутствуют только в некоторых клеточных клонах гонад и не определяются в соматических клетках), как например при миодистрофии Дюшенна.
Следует также учитывать, что для ряда нозологии (например, гемофилии А, миодистрофии Дюшенна) необычно высока частота спонтанных
мутаций соответствующих генов (фактора VIII свертывания крови и дистрофина соответственно). Поэтому до решения вопроса о ПД в таких
семьях особенно важно решить вопрос о наличии гетерозиготного носительства мутации соответствующих генов у матери.
- Выбором оптимального срока ПД
[показать] .
Решающим преимуществом молекулярной диагностики является ее универсальность, возможность использовать для анализа
любые ДНК-содержащие клетки организма или ткани. Анализ может быть проведен на любой стадии онтогенеза, начиная со стадии зиготы.
Реально уже сегодня ряд моногенных болезней (муковисцидоз, фенилкетонурия, миодистрофия Дюшенна, гемофилии) можно диагностировать
в доимплантационном периоде. Материалом для диагностики могут служить полярные тельцa зиготы или отдельные бластомеры дробящейся
яйцеклетки, полученные микрохирургическим путем от доимплантационных зародышей - продуктов экстракорпорального оплодотворения [31].
Эти исследования, однако, пока находятся на стадии научных разработок.
Исходя из интересов женщины, оптимальным для ПД молекулярными методами, считается 1 триместр. Это, однако, требует детального
ДНК-обследования семьи еще до наступления беременности. Нередко ДНК-диагностику проводят и во II триместре, особенно в случае
частично информативных семей, когда существует возможность дополнить ДНК-диагностику соответствующими биохимическими (при муковисцидозе)
или серологическими (при гемофилии А) тестами.
- Возможностью получения материала плода для ПД генных болезней
[показать] .
В отличие от биохимических методов исследования ДНК-диагностика возможна на любых клетках плода и его провизорных органов.
Такие клетки могут быть получены при помощи стандартных инвазивных методов, рассмотренных ранее. Образцы ДНК выделяют из биоптатов
хориона (плаценты), клеток амниотической жидкости или лимфоцитов пуповинной крови плода. При необходимости для молекулярного анализа
можно использовать соскоб клеток с цитологических препаратов, ранее использованных для кариотипирования зародыша.
Обследование семей высокого риска и даже больных в случае некоторых генных болезней (муковисцидоз, фенилкетонурия) проводят на
пятнах крови, нанесенных на фильтровальную бумагу. Это значительно облегчает транспортировку и хранение образцов из удаленных от
диагностических центров районов. Однако для многих других генных болезней (гемофилия А, миодистрофия Дюшенна, миотоническая дистрофия и
др.) ДНК-диагностика возможна только на чистых препаратах ДНК, выделенных из крови.
- Четкостью рекомендаций после молекулярной пренатальной диагностики
[показать] .
Исходом ДНК-диагностики может быть подтверждение диагноза или его отрицание. В последнем случае плод может быть
гетерозиготным носителем (в случае наиболее частых аутосомно-рецессивных болезней) или не быть носителем мутантного гена.
В любом случае женщина (семья) должна быть в максимально сжатые сроки осведомлена о результатах диагностики с оценкой степени
риска рождения больного плода, гетерозиготного носителя или полностью здорового ребенка соответственно.
В случае высокого риска рождения больного ребенка женщине может быть рекомендовано прерывание беременности, однако окончательное
решение о сохранении или прерывании беременности всегда остается прерогативой самой пациентки. В случае прерывания беременности
при наличии соответствующих условий настоятельно рекомендуется верификация диагноза молекулярными или другими доступными методами.
Проблема выбора может возникать и в случае гетерозиготного носительства (например, мутантных генов гемофилии А, миодистрофии Дюшенна
или синдрома ломкой Х-хромосомы).
- Наличием скринирующих программ в ДНК-диагностике
[показать] .
Возможность выявлять больных и гетерозиготных носителей моногенных болезней уже на ранних стадиях постнатального
развития может иметь большое практическое значение в плане рациональной профилактики этих заболеваний. Однако реально такие программы
применимы только к тем моногенным болезням, для которых можно идентифицировать не менее 90% всех мутантных хромосом, т.е. хромосом,
несущих мутантные гены.
Подобные программы уже разработаны и успешно используются в ряде развитых стран Европы и Америки для выявления досимптоматических
больных и бессимптомных гетерозиготных носителей серповидно-клеточной анемии и муковисцидоза.
В России пока доступны идентификации только около 65-70% хромосом с мутациями гена муковисцидоза, что явно недостаточно для внедрения
скринирующих программ ДНК-диагностики. В настоящее время Приказом Минздрава РФ N 361 определена необходимость антенатального скрининга
биохимическими методами таких генных болезней, как фенилкетонурия, гипотиреоз и галактоземия.
Основные подходы в пренатальной диагностике генных болезней ДНК-методами
Отличительной чертой молекулярной диагностики является ее универсальность. Это означает, что диагностика может проводиться на любой стадии
онтогенеза, в т. ч. до рождения, и материалом для ДНК-анализа могут быть любые клетки и ткани плода.
В настоящее время в ПД, равно как и во всякой другой диагностике генных болезней, существуют два основных подхода:
- прямая диагностики, основанная на непосредственной идентификации мутаций в определенном гене;
- косвенная (непрямая) диагностика, в основе которой лежит маркирование мутантного гена (иногда называемая маркированием хромосомы,
несущей мутантный ген) с помощью молекулярных маркеров.
Рассмотрим кратко эти подходы.
Прямая диагностика
Основу прямой диагностики составляет идентификация мутаций в самом гене. Преимущества метода:
- высокая (приближающаяся к 100%) точность диагностики;
- возможность ПД, анализа информативности (пригодности для молекулярной диагностики) семьи и выявление гетерозиготных носителей при
отсутствии больного ребенка.
Недостаток метода - отсутствие сведений о мажорных мутациях генов некоторых заболеваний, требующее, зачастую, достаточно детального
молекулярного сканирования его первичной структуры с целью обнаружения мутаций. Более подробно алгоритмы молекулярной диагностики различных
моногенных болезней приведены в главе "Медицинская лабораторная диагностика наследственных
болезней" и в специальной литературе [9].
Косвенная диагностика
Непрямой (косвенный) подход в молекулярной диагностике исторически более ранний и более универсальный. Он основан на анализе внутри- и
внесенных полиморфных сайтов (см. "Медицинская лабораторная диагностика наследственных
болезней"). Непременным условием проведения косвенной ДНК-диагностики является наличие в семье больного ребенка или возможность исследования
его ДНК (сохранившихся пятен крови, гистологических препаратов в случае его гибели) для установления информативности семьи.
Установление информативности предусматривает выявление такого полиморфного сайта, который может быть использован в качестве молекулярного
маркера как мутантного, так и нормального аллеля. При этом в случае aутосомно-рецессивных заболеваний родители больного будут определяться
как гетерозиготы по данному полиморфизму, а больной будет гомозиготой по одному из маркерных аллелей. Именно гетерозиготность по молекулярным
полиморфизмам определяет информативность той или иной семьи высокого риска рождения ребенка с генной патологией.
В зависимости от типа полиморфизма (подробнее см. "Медицинская лабораторная диагностика наследственных
болезней"), гетерозиготность и соответственно информативность семьи варьирует от 50 до 90%.
В зависимости от распределения маркерных аллелей на гомологичных хромосомах больного и его родителей семья может быть
полностью или частично информативной, или неинформативной (рис. 13.8).
Принципиально важно проанализировать в семье высокого риска такое количество полиморфных сайтов одного гена, чтобы точно определить, с каким
конкретным аллелем наследуется мутантный ген и, таким образом, сделать семью полностью информативной для последующей ПД. Решающее преимущестио
косвенного метода - возможность ДНК-диагностики без точной идентификации мутации в самом гене и даже при отсутствии данных о точной идентификации
и клонировании самого мутантного гена. Существенными недостатками являются:
- невозможность диагностики при отсутствии больного ребенка (нельзя точно определить, с каким полиморфным аллелем сцеплен мутантный ген);
- возможность ошибки диагноза, обусловленная переносом полиморфного сайта на "здоровый" аллель вследствие кроссинговера.
Точность молекулярной диагностики, возможные источники ошибок
В ПД молекулярными методами важно учитывать два основных источника ошибок:
- Контаминация плодного образца материнскими клетками.
- Возможность кроссинговера при использовании непрямого метода.
Учитывая крайне высокую чувствительность метода ПЦР, избежать загрязнения образцов плодных тканей материнскими клетками можно только путем
тщательного отбора ворсинок хориона или плаценты под бинокулярной лупой с последующим отмыванием физиологическим раствором. Особенно важно не
допустить попадания материнской крови в образец пуповинной крови плода при получении материала методом кордоцентеза. Высокий уровень оператора
и использование качественных реакций на выявление примеси материнской крови позволяют избежать этого осложнения.
Риск диагностических ошибок при проведении ПЦР может быть значительно уменьшен путем работы в стерильных лабораторных условиях.
Достоверность молекулярной диагностики прямым методом, т.е. путем идентификации мутаций в самом гене, очень высока и приближается к абсолютной.
Несмотря на такую точность, учитывая все многообразие возможных изменений в геноме при созревании гамет (кроссинговер) и на начальных стадиях
эмбриогенеза (мутагенный эффект), вернее полагать, что точность прямой диагностики составляет 99,9%.
Значительно сложнее оценка результатов
молекулярной диагностики косвенным методом. В случае учета внутригенных полиморфизмов точность непрямой диагностики достаточно высока, т.к.
величина внутригенного кроссинговера, как правило, не превышает 0,1 % для большинства известных генов. Исключение могут составлять только
сравнительно крупные гены, такие как ген дистрофина, гемофилии A, нейрофиброматоза и некоторые другие. Так, в случае дистрофина ошибка диагноза
может достигать 2%, что соответствует высокой частоте внутригенного кроссинговера (около 2%) в этом гигантском гене (2,2 млн п. о.). Важно также
учитывать степень родства больного и пробанда, у которого проводится ПД. Величина возможной ошибки возрастает, если маркерный аллель определяется
не у сибса плода, а у других его родственников.
Особенно осторожно следует оценивать результаты непрямой диагностики с использованием внегенных полиморфных локусов. Считается, что с
уверенностью проводить ПД в этих случаях можно только при одновременном тестировании нескольких полиморфных сайтов, фланкирующих мутантный ген.
Обычно для молекулярной диагностики используют маркеры, частота рекомбинаций которых с мутантными аллелями гена не превышает десятых или сотых
долей процента.
Характеристика ДНК-полиморфизмов, последовательности праймеров для ПЦР, величины погрешности непрямых методов для различных заболеваний,
диагностируемых пренатально, приведены в монографии В.Н.Горбуновой и В.С.Баранова [9].
Комбинированная диагностика
В ряде случаев (частичная информативность) ДНК-диагностика некоторых заболеваний может быть дополнена другими диагностическими исследованиями
(рис. 13.9). При муковисцидозе дополнительная информация о состоянии плода может быть получена путем биохимического исследования активности
ферментов микроворсинок кишечника плода в амниотической жидкости на 17-19 неделях беременности. Разработанный и широко применяемый в нашей
лаборатории алгоритм ПД муковисцидоза приведен на рис. 13.10.
В случае гемофилии А возможно прямое определение уровня фактора VIII свертывания крови в пуповинной крови плода после 20-й недели беременности.
ДНК-диагностика адреногенитального синдрома может быть дополнена прямым исследованием содержания 17-ОН прогестерона в амниотической жидкости.
ПД синдрома ломкой Х-хромосомы нередко дополняют прямым цитогенетическим анализом культуры лимфоцитов пуповинной крови плода, а в случае
неинформативности ДНК-диагностики при миодистрофии Дюшенна принципиально возможен иммуноцитохимический анализ биоптата скелетных мышц плода.
ЛИТЕРАТУРА
[показать] .
- Баев Л.Л. Вводные замечания // Итоги пауки и техники: Геном человека: Т.2.- М.: ВИНИТИ,1994. - С. 3-8.
- Баранов В.С. Проблемы пренатальной диагностики наследственных болезней и возможные пути их коррекции // Биополимеры и клетка,- 1990.- Т. 6, №1.- С.46-51.
- Баранов В.С. Ранняя диагностика наследственных болезней в России. Современное состояние и перспективы // Межд. Мед. Обзоры.- 1994,- Т. 2, №4.- С. 236-243.
- Баранов В.С. Пренатальная диагностика и генетика развития человека // Вест. Росс. Асс. акушеров-гинекологов.- 1997.- №3.- С. 44-46.
- Баранов В.С.. Кузнецова Т.В. Особенности организации, основные итоги и перспективы пренатальной диагностики в Санкт-Петербурге// Принципы организации и методические основы профилактики инвалидизирующих наследственных болезней.- М., 1996.- С. 19-22.
- Баранов В.С., Кузнецова Т.В., Баранов А.Н., Швед Н.Ю. Пренатальная диагностика хромосомных болезней у плода / Методические рекомендации,- СПб.: МЗ МП РФ, 1995.- 21 с.
- Бочков Н.П. Генетические технологии в педиатрии // Педиатрия.- 1995.- №4.- С. 21-26.
- Вельтищев Ю.Е., Казанцева Л.З. Клиническая генетика: значение для педиатрии, состояние и перспективы // Материнство и детство. - 1992,- №8-9,- С. 4-11.
- Горбунова В.Н., Баранов В.С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний.- СПб.: Спец. литература, 1997,- 286 с.
- Золотухина Т.В., Костюк Э.В. Использование скрининговых исследований факторов материнской сыворотки в профилактике врожденных пороков развития и хромосомных болезней у человека // Новое в ИФА-диагностике / Сборник материалов III конф. "ДИАплюс", Суздаль.- 1992.- С. 46-49.
- Ивашенко Т.Э. Идентификация мутаций при муковисцидозе // Автореф. дисс. ... канд. биол. наук,- М.- 1992.
- Ивашенко Т.Э., Асеев М.В., Малышева О.В. и др. ДНК-методы в пренатальной диагностике генных болезней // Вест. Росс. Асе. акушеров-гинекологов.- 1997.- №3.- С. 46-49.
- Кузнецова Т.В., Баранов А.Н., Киселева Н.В. и др. Пренатальная диагностика хромосомных болезней у плода: десятилетний опыт // Вест. Росс. Асе. акушеров-гинекологов.- 1997.- №3.- С. 95-99.
- Кулиев А.М., Дубинина И.Г., Гречанина Е.Я. и др. Базовые уровни альфафетопротеина в зависимости от срока беременности // Вопр.охраны материнства и детства - 1990 - №9.- С. 34-38.
- Ромео Р., Пилу Д., Дженти Ф. и др. Пренатальная диагностика врожденных пороков развития плода.- М.: Медицина, 1994.- 448 с.
- Снайдерс Р., Николаидес К. Ультразвуковые маркеры хромосомных дефектов плода - М.: ВИДАР, 1997.- 191 с.
- Шишкин С.С., Калинин В.Н. Медицинские аспекты биохимической и молекулярной генетики.- М.: ВИНИТИ, 1992.- 215 с.
- Baranov V.S., Ginter E. K. Genetic services in Russia. Concerted Action on Genetics Services in Europe (CAGSE). - 1997.
- Canicл J.A., Knight G.J., Palomaki G. E. et al. Low second trimester maternal serum unconjugated oestriol in pregnancies with Down's syndrome // Brit. J. Obst. Gynec. - 1988.- Vol.95.- P. 330-333.
- Cuckle M.S., Wald N.J. Screening for Down's syndrome // Prenatal Diagnosis and Prognosis / Ed. by Lilford L. J.- Butterworth, 1990.- P. 67-92.
- Cuckle H.S. Improved parameters for risk estimation in Down's syndrome screening // Prenat. Diagn.- 1995.- .Nb 15. - P. 10o7- 1065.
- Hino M., Koki Y., Nishi S. Nimpu ketsu naka no alphafetoprotein // Igaku No Ayumi.- 1972.- № 82.- P. 512-513.
- Kalousek O.K., Dill F.J. Chromosomal mosaicism confined to the placenta in human conceptions // Science.- 1983.- Vol.221.- P. 665-667.
- Ledbetter D. H., Zachary J.M., Simpson J. I. et al. Cytogenetic results from the U. S. collaborative study on CVS // Prenat.Diagn.- 1992.- Vol. 12.- P. 317-345.
- McKusick V. A. Mendelian inheritance in man: a catalog of human genes and genetic disorders.- Baltimore: Johns Hopkins Univ. Press, 1994.
- Mercatz I. R., Nitowsky H.M., Macri J. N., Johnson W. E. An association between low maternal serum alpha-fetoprotein and fetal chromosomal abnormalities // Amer. J. Obstetr. Gyneco!.- 1984.- Vol.148,- P. 886-894.
- Mikkelsen M., Philip J., Therkelsen A. J. et al. / Prenatale undersogelser i Danmark.- Glostrup.- 1988.- 54 p.
- Report of European study group on prenatal diagnosis. Recommendations and protocols for prenatal diagnosis.- Barselona: Dept. Ob-stetr. & Gynecol, 1993.- 61 p.
- Simoni G., Sirchia S.M. Confined Placental mosaicisni // Prenat.Diagn.- 1994.- Vol.3.- P. 1185-1190.
- Simoni G., Brambati B., Danesino C. et al. Efficient direct chromosome analysis and enzyme determinations from chorion villi samples in the first trimester of pregnancy // Hum.Genet.- 1983.- Vol.63.- P. 349-357.
- Verlinsky Y., Kuliev A. Preimplantation diagnosis of genetic diseases // New Technic in assisted reproduction.- N.-Y.: Willey-Liss, 1993.- 155 p.
- Wald N.J., Cucle U.S., Densem J. W. et al. Maternal serum screening for Down's syndrome in early pregnancy // Brit. Mecl. J.- 1988.- Vol.297.- P. 883-887.
- Wolstenholme J., Rooney D. E., Davison E. V. Confined placental mosaicism, IUGR, and adverse pregnancy outcome: a controlled retrospective U. K.. collaborative survey // Prenat. Diagn.- 1994.- Vol.14.- P. 345- 361.
Страница
1
2
3
| всего страниц: 3 |
Источник: Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, Интермедика, 2001
|
|
На нашем форуме вы можете задать вопросы о проблемах своего здоровья, получить
поддержку и бесплатную профессиональную рекомендацию специалиста, найти новых знакомых и
поговорить на волнующие вас темы. Это позволит вам сделать собственный выбор на основании
полученных фактов.
Обратите внимание! Диагностика и лечение виртуально не проводятся!
Обсуждаются только возможные пути сохранения вашего здоровья.
Подробнее см. Правила форума
[X]
Беседы с опытным психологом по Skype. Консультации, психотерапия.
Стоимость 1 часа - 500 руб. (с 02:00 до 16:00, время московское)
С 16:00 до 02:00 - 800 р/час.
E-mail: aristo@newmail.ru
Последние сообщения
Реальный консультативный прием ограничен.
Ранее обращавшиеся пациенты могут найти меня по известным им реквизитам.
Нажми на картинку - узнай подробности!
Ссылки на внешние страницы
20.05.12
Уважаемые пользователи!
Просьба сообщать о неработающих ссылках на внешние страницы, включая ссылки, не выводящие прямо на нужный материал,
запрашивающие оплату, требующие личные данные и т.д. Для оперативности вы можете сделать это через форму отзыва, размещенную на каждой странице.
Ссылки будут заменены на рабочие или удалены.
Тема от 05.09.08 актуальна!
Остался неоцифрованным 3-й том МКБ. Желающие оказать помощь могут заявить об этом на
нашем форуме
05.09.08
В настоящее время на сайте готовится полная
HTML-версия МКБ-10 - Международной классификации болезней, 10-я редакция.
Желающие принять участие могут заявить об этом на нашем форуме
25.04.08
Уведомления об изменениях на сайте можно получить через
раздел форума "Компас здоровья" - Библиотека сайта "Островок здоровья"
|
|