Данный материал перенесен с форума "Компас здоровья" для обеспечения сохранности в связи с частичным удалением с сайта радикал картинок пользователя, разместившего данный материал на форуме и отсутствием ответа на запрос о сложившейся ситуации от владельцев ресурса.

Лапин Сергей Владимирович, к.м.н.
Тотолян Арег Артемович, д.м.н., проф.
Научно-Методический Центр МЗиСР
по Молекулярной Медицине
СП6ГМУ им. акад. И.П. Павлова

197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8
Тел./факс: (812) 499-71-94

Список сокращений [показать]

ВВЕДЕНИЕ

Значение иммунологии в теории и практике медицины постоянно возрастает. Являясь сплавом биологических и патоморфологических концепций, иммунология внесла значительный вклад в изучение патогенеза множества нозологических форм и патологических состояний во всех областях медицины.

Иммунологические методы в настоящее время используются в диагностике множества различных заболеваний, но ни в одной другой области медицины иммунологическая диагностика не играет такой значительной роли, как в ревматологии.

Ведущим патогенетическим механизмом развития аутоиммунных заболеваний является иммунный ответ по отношению к компонентам нормальной человеческой ткани и органов. Этот патологический ответ собственно и называется аутоиммунным. Он может быть направлен на индивидуальные органы или группы органов или может поражать несколько систем органов, как это происходит при ревматических заболеваниях. В последнем случае нередко клиницисты определяют аутоиммунный ответ как "системный". В отличие от него, выделяют "органоспецифичные" аутоиммунные заболевания, когда иммунная система поражает только один орган-мишень.

По мере понимания патогенеза аутоиммунных заболеваний эта классификация постепенно утрачивает свое значение. Так, при многих "органоспецифичных" аутоиммунных процессах обычно находят признаки поражения других органов. В качестве примера можно привести артриты при воспалительных заболеваниях кишечника, частое развитие аутоиммунного гастрита на фоне, тиреоидита, полиэндокринопатии.

Необходимо подчеркнуть, что в большинстве академических определений ревматических заболеваний отсутствует слово "аутоиммунное" и используется термин "воспалительное". Однако большинство классических воспалительных ревматических заболеваний фактически относятся к аутоиммунным, так как удовлетворяют критериям аутоиммунных заболеваний Розе-Бона, 1993 г.

Прежде всего, в основе их патогенеза лежит хроническое воспаление ткани, обусловленное неизвестной этиологической причиной. Эти заболевания возникают у лиц с характерным набором генов системы НLА, то есть генов, определяющих особенности иммунного ответа. Большинство ревматических заболеваний поддаются терапии препаратами, подавляющими функции иммунной системы. Кроме того, в биологических жидкостях и тканях больных ревматической патологией могут быть обнаружены диагностически значимые аутоантитела.

Эти биологические особенности аутоиммунных процессов используются в их практической диагностике. Общность патогенеза позволяет рассматривать ревматические заболевания в ряду других аутоиммунных заболеваний и использовать в их иммунологической диагностике общую методологию и подходы.

При морфологических исследованиях ткани определяется не только тканевое воспаление, но и выявляются отложения иммунокомпетентных молекул. К таким методам относят биопсии почки и кожи, при которых световая микроскопия дополняется прямым иммунофлюоресцентным исследованием, выявляющим отложения иммуноглобулинов и факторов комплемента в тканях. Воспаление оценивается по активации иммунной системы, прежде всего благодаря исследованию ряда сывороточных белков, связанных с острофазным ответом, таких как С-реактивный белок. Далеко не все аутоиммунные заболевания сопровождаются выраженной активацией иммунной системы и острофазным ответом.

Говоря об аутоиммунных заболеваниях, нельзя не коснуться их вероятной связи с инфекционными заболеваниями. Действительно, ревматизм (острая ревматическая лихорадка) относится к числу классических аутоиммунных заболеваний, однако стрептококковая этиология его возникновения не вызывает сомнений. Многие другие аутоиммунные заболевания имеют вероятную инфекционную причину, например связь инфекции, вызванной Campilobacter jejuni и полирадикулонейропатии Гийома-Барре.

Взаимоотношение иммунной системы организма и инфекционных агентов активно изучается, однако, за редким исключением, эти взаимоотношения остаются недостаточно охарактеризованными. Особенности генетики иммунной системы, прежде всего генов системы основного комплекса гистосовместимости человека, которые отвечают за распознавание внешних и внутренних антигенов, обуславливают предрасположенность к аутоиммунным заболеваниям и их наследование. Генотипирование генов системы НLА используется для диагностики серонегативных спондилоартропатий, выявление общего эпитопа генного аллеля НLА-DR4 используется в диагностике ревматоидного артрита. Генотипирование других генов до настоящего времени имеет ограниченное значение в диагностике классических аутоиммунных заболеваний, однако сравнительно недавно описан ген АIRЕ (аутоиммунный ген-регулятор), дефект которого, отмечается при врожденных аутоиммунных эндокринологических синдромах.

Аутоантитела, направленные против собственных молекул организма, зачастую не связаны с непосредственным повреждением ткани при аутоиммунных заболеваниях, чаще всего они являются "свидетелями" аутоиммунного процесса. Выявление аутоантител при аутоиммунной патологии позволяет широко использовать их для практической лабораторной диагностики аутоиммунных заболеваний. По аналогии с инфекционными процессами, где серодиагностика играет одну из ведущих ролей, серодиагностика аутоиммунных процессов является важным инструментом в выявлении и последующем ведении пациентов.

ПРИНЦИПЫ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ТЕСТОВ

Целью лабораторного обследования является определение текущего состояния и выявление патологических процессов, протекающих в человеческом организме. Все патологические процессы не могут быть полностью охарактеризованы, так как существует объективный предел применяемых методов. Подробное изучение большинства из них существующими биомедицинскими методами невозможно без значительного ущерба для здоровья обследуемого. Материальные и технические затраты также накладывают ограничения на исследование состояния конкретного больного. Наконец, не все патологические процессы важны для клинической диагностики и назначения лечения.

Хотя большинство лабораторных методов исключительно точны и воспроизводимы, результат лабораторного теста представляет собой измерение параметров в некой искусственной модельной системе, то есть в лабораторном методе. Результат этих измерений лишь косвенно отражает процессы, происходящие в организме обследуемого.

С другой стороны, показатели изменяются под действием патологического процесса, возраста, уникальных особенностей индивидуума. Четких значений биологической нормы у человека не существует, и значения лабораторных показателей характерны для каждого конкретного человека в конкретных условиях и времени.

Невозможность определения нормы для каждого человека приводит к необходимости сопоставления результатов тестирования с условными границами (нормальных значений, патологии, критическими границами и т.д.). В этом случае норма представляет собой величину, определяемую с помощью научных исследований на искусственно отобранных популяциях людей. Не менее важными являются частота патологических результатов анализов в различных популяциях и пределы патологических значений для различных популяций обследуемых.

Таким образом, лабораторное обследование представляет собой компромисс между целесообразностью, методическими ограничениями, финансовыми и материальными затратами, а также сопоставлением конкретного обследуемого человека с научными результатами популяционных исследований.

Современная лаборатория представляет собой сложную организацию, использующую медико-биологические знания и научный подход одновременно с управленческими, рыночными и финансовыми подходами. Для лабораторного тестирования выстраивается сложная технологическая цепочка, сопоставимая с промышленным производством, включающая контроль качества, оценку эффективности, времени и затрат, однако окончательным продуктом работы лаборатории является информация, выраженная на бланке ответа лабораторного обследования. Эффективное применение этой информации у постели больного зависит от многих аспектов, большая часть из которых определяется лабораторией.

Лаборатория должна поддерживать стандартное качество и воспроизводимость предоставляемых тестов, анализы должны выполняться в сроки, соответствующие ургентности и клиническому обследованию. Информация о выполненных исследованиях должна храниться и быть доступна в течение достаточно длительного времени.

Номенклатура определяемых показателей имеет большое значение в достижении взаимопонимания между клиницистом и лабораторным работником. Границы нормы должны быть получены из известных источников, лаборатория должна участвовать в программах внешнего контроля качества, которые определяют сопоставимость результатов лабораторных анализов разных лабораторий. Известные врачу-лаборанту ограничения и характеристики используемых методов, неустранимые особенности их выполнения, доступные литературные ссылки на границы нормы лабораторных тестов должны предоставляться клиницисту по его требованию.

Удобство для больного и его лечащего врача, определяемое территориальной удаленностью лаборатории, организацией работы, отсутствием задержек, ясностью лабораторного бланка и приемлемой ценой, также является компонентом, определяющим удовлетворение результатами обследования.

Основные понятия лабораторной диагностики

Иммунологические методы являются частью медицинской диагностики вообще, а их клиническое применение основано на общих принципах.

Любой метод диагностики: клинический, физикальный, инструментальный, морфологический или лабораторный — описывает какой-либо биологический феномен в человеческом организме. Для того чтобы определение этого явления стало диагностическим тестом и могло быть использовано в клинических целях, оно должно быть воспроизводимо и изучено применительно к стандартным клиническим задачам в разных популяциях больных.

Диагностический показатель представляет собой биологический феномен, возникающий или изменяющийся при патологии, который может быть обнаружен с помощью стандартизованного диагностического метода.

Под лабораторным методом понимают определенную технологию, направленную на выявление лабораторного показателя. Однако для определения одного показателя может быть использовано несколько методов. Например, для выявления антител к двуспиральной ДНК используется 3 методических подхода, каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки. В рамках каждой технологии возможны модификации, а лаборатории обычно используют реактивы разного качества. В результате разные методы имеют свои аналитические характеристики, и результаты определения одного и того же показателя разными методами могут значительно отличаться. Как следствие, при использовании разных методов определения одного и того же показателя отличаются как границы нормы, так и диагностическое значение показателя.

Для того чтобы избежать путаницы в методических особенностях выявления диагностических показателей, в лабораторной медицине используется еще одно понятие — диагностический тест.

Диагностический тест представляет собой определение диагностического показателя с помощью конкретного лабораторного метода, аналитические параметры которого остаются на постоянном уровне при условии контроля качества его выполнения.

Результатом использования диагностического теста является получение данных. Вне зависимости от характера получаемых данных (качественных или количественных) результаты каждого теста могут быть условно разделены на положительные и отрицательные. Обычно в качестве такой условной границы используется одна из границ нормы, однако могут быть выделены другие границы. Последние могут быть использованы для решения других клинических задач, например определения прогностических факторов, факторов риска или контроля терапии.

Хотя большинство тестов могут использоваться для решения нескольких клинических задач, аналитические характеристики лабораторного теста обычно определяются именно при постановке диагноза. Процесс установления диагноза несовершенен. Мы можем лишь предполагать, что диагноз верен, нежели утверждать это со всей определенностью. Раньше врачи выражали степень уверенности в клиническом диагнозе, предваряя его словами "исключено" или "возможно". Современные клиницисты все чаще выражают свою уверенность в диагнозе через вероятности. Следовательно, врач должен понимать математическую суть диагностической ценности теста в различных ситуациях. Как правило, это помогает врачу уменьшить степень неопределенности той или иной диагностической ситуации, а в ряде случаев точнее оценить эту неопределенность, а иногда лишь осознать степень своей неуверенности в диагнозе.

При оценке аналитических параметров теста он используется на двух группах обследованных: больных с заболеванием и контрольной популяции. Соотношение между результатами тестирования и верным диагнозом представлено в таб. 1. Всего возможно четыре варианта толкования результатов теста — два истинных и два ложных.

Наиболее важными параметрами любого теста являются

• аналитическая точность
• диагностическая чувствительность
• и диагностическая специфичность.

Для сравнения разных диагностических тестов между собой используется понятие аналитической точности, представляющей собой число истинных результатов к числу всех результатов обследования. С помощью этого показателя можно сопоставить различные методы определения одного показателя при обследовании одной популяции больных.

Чувствительность представляет собой число корректных положительных результатов обследования к общему числу обследованных больных. Специфичность указывает на число корректных отрицательных результатов обследования к общему числу контрольной группы.

Чувствительный тест следует выбрать, если есть риск пропустить заболевание при неясной диагностической картине или сузить рамки диагностического поиска, исключив ряд частых причин с помощью высокочувствительных тестов. В последнем случае для врача чувствительный тест наиболее информативен, когда он дает отрицательный результат.

Специфические тесты нужны для подтверждения диагноза, предложенного на основании других данных. Высокоспецифичные тесты особенно необходимы, если ложноположительный результат может нанести пациенту вред, например, в результате ошибочно назначенного лечения.

Для того чтобы уточнить вероятность постановки диагноза с помощью теста в стандартной клинической ситуации, используется понятие предсказательной ценности (predictive value) (рис. 1. Расчет основных клинико-лабораторных показателей диагностических методов - утрачен с сайта radikal).

Так, предсказание положительного результата теста (ППР) определяется как вероятность того, что пациент болен, если получен положительный результат теста. ППР непосредственно зависит от специфичности теста. При высоких значениях этого показателя можно считать, что полученные результаты подтверждают предполагаемый диагноз.

Предсказание отрицательного результата (ПОР) определяет вероятность того, что обследованный здоров, если получен отрицательный результат теста. Чем чувствительнее тест, тем выше его ПОР. То есть, возрастает уверенность врача в том, что отрицательные результаты теста отвергают наличие заболевания.

Важно подчеркнуть, что ППР и ПОР являются вторичными показателями, так как прямо зависят от соотношения числа больных в группе с заболеванием и числа лиц контрольной группы. Чем больше было обследовано больных по сравнению с контрольной группой, тем выше ППР, и наоборот, чем меньше больных было обследовано для определения аналитических параметров теста, тем выше ПОР. Объяснение этому феномену будет приведено ниже.

Чувствительность и специфичность лабораторного теста зависят от выбранной границы нормы. Чем ниже граница нормы, тем выше чувствительность теста, то есть тем больше положительных ответов отмечается среди больных. В то же время пропорционально будет возрастать число ложноположительных ответов в группе контроля.

Понятие нормы, как и понятие здоровья, весьма условно. Хотя предполагается, что большинство тестов должны, прежде всего, отделять больных от здоровых, однако это справедливо только для некоторых генетических и микробиологических тестов, где патологический ген или микроорганизм либо присутствует, либо отсутствует.

Можно определить понятие "нормальные границы" теста как биологическое и медицинское понятие. Если биологическая норма определяется биологической вариацией изучаемого параметра в популяции, то медицинская норма, прежде всего, определяется теми клиническими задачами, которые предполагается решить с помощью применяемого диагностического вмешательства. Так, с медицинских позиций, более корректно рассматривать результат любого теста не в связи с нормой, а в связи с риском неблагоприятного исхода, который основан на эпидемиологических наблюдениях за состоянием здоровья сходной клинической популяции.

Медицинская норма зависит от современных представлений медицинской науки. Так, верхняя граница нормы для С-реактивного белка (СРВ), которая используется для диагностики воспалительных заболеваний, составляет 10 мг/л, а в случае, если используются новые высокочувствительные тесты определения СРВ для диагностики нестабильной стенокардии или риска сердечно-сосудистых заболеваний, составляет 4 мг/л.

Если использовать сравнительно низкую границу нормы, то чувствительность будет высока, что позволит не пропустить пациентов с заболеванием. В то же время, если для решения клинической задачи необходимо использовать высокоспецифичный тест, условная граница нормы может быть повышена. Наличие нескольких границ нормы и патологии определяет информативность теста, которая представляет собой условное понятие, учитывающее то количество диагностической информации, которое может быть получено в результате его применения.

Иммунологические тесты традиционно относят к высокоинформативным, так как иммунологическое обследование предоставляет клиницисту большой объем аналитической информации. Так, только определение антинуклеарного фактора на клеточной линии НЕр-2 дает клиницисту сведения о наличии или отсутствии антинуклеарных антител, позволяет определить титр аутоантител, который коррелирует с активностью ряда ревматических заболеваний, а также описать более 6 типов свечения ядра клетки, которые позволяют предположить конкретные разновидности аутоантител, присутствующих в сыворотке больного. Не зря высокая информативность определяет высокую частоту назначений определения АНФ в иммунологических лабораториях.

Особенности применения лабораторных тестов в клинических условиях

Хотя специфичность и чувствительность представляют для врача объективные показатели, оценивающие качество лабораторного теста, однако результат использования теста зависит от клинической ситуации. Собственно, существует две ситуации, в которых назначается обследование — когда вероятность заболевания высока и вероятность заболевания низка. В первом случае у больных уже имеется ряд клинических признаков заболевания или факторов риска. Во втором случае, например, когда другие клинические данные недоступны, то вероятность равна эпидемиологической распространенности заболевания в данной популяции, которая обычно мала.

Для того чтобы оценить вероятность заболевания после получения определенного результата теста, используется определение "посттестовой вероятности".

Основой расчета посттестовой вероятности является статистическая теорема Байеса, которая объединяет специфичность, чувствительность и распространенность заболевания. Расчетная формула приведена на рис. 1. Хотя ее практическое использование затруднено тем фактом, что специфичность, чувствительность и распространенность заболевания практически невозможно исследовать в каждой клинической популяции, применение этой формулы позволяет сделать ряд важных выводов.

Результаты использования тестов будут различны в ситуациях с высокой и низкой распространенностью заболевания. Если положительные результаты даже высокоспецифичного теста получены в популяции с низкой распространенностью заболевания, то они окажутся преимущественно ложноотрицательными. Иными словами, в популяции с низкой распространенностью заболевания ППР любого изолированного теста стремится к нулю. Аналогично, отрицательные результаты высокочувствительного теста, полученные в популяции с высокой вероятностью заболевания, будут преимущественно ложноотрицательными, то есть его ПОР очень низка.

Поскольку посттестовая вероятность заболевания зависит от распространенности заболевания в группе обследованных, становится понятным, почему врачи стремятся применять диагностические тесты в группах больных с повышенной распространенностью предполагаемой болезни. Диагностические тесты наиболее эффективны, когда распространенность заболевания не слишком высока и не слишком низка (рис. 2. Прогностическая ценность положительного результата теста в зависимости от чувствительности, специфичности и распространенности заболевания - утрачен с сайта radikal).

Следовательно, диагностические тесты целесообразно использовать в группах со сравнительно высокой распространенностью заболевания, что позволяет добиться снижения удельного веса ложных результатов обследования. Таким образом, более специализированная иммунологическая лаборатория, получающая биологический материал преимущественно от больных с ревматическими заболеваниями, будет всегда иметь меньшее число ложных результатов.

В то же время, для того чтобы получать максимум от высокоинформативных методов диагностики и избежать ложных результатов, желательно, чтобы врач проводил более тщательный отбор больных на обследование, учитывая распространенность заболевания в популяционных группах. Так, встречаемость ревматоидного артрита будет во много раз ниже у пациентов с суставным синдромом в 20 лет, чем у пациентов с той же симптоматикой в 40 лет.

Для оценки вероятностей на практике более удобным показателем является "отношение вероятности". Оно определяет, во сколько раз выше (или ниже) вероятность получить данный результат теста у больных, нежели у здоровых. Для большинства иммунологических методов этот показатель составляет 1/5-1/10. Это объясняет, почему для получения однозначного результата целесообразно направлять на обследование лиц, у которых претестовые шансы (распространенность патологии) составляет 1/10, но не опускаются меньше 1/50-1/100. Так, в случае если распространенность патологии равна 1/100, то даже для очень хорошего теста с чувствительностью, близкой к 100%, при специфичности 95%, только каждый пятый положительный тест будет истинным.

Другим эффективным методом для увеличения эффективности диагностики является использование комбинаций тестов. Существует два способа применения комбинации тестов — параллельный и последовательный. Несколько тестов назначается параллельно, когда необходима быстрая оценка состояния больного. Это обычно происходит при сборе анамнеза, назначении обследования при диспансеризации или у госпитализированных больных при неотложных состояниях. Задачей любых параллельно назначаемых тестов является повышение претестовых шансов для назначения более специфичных тестов. Естественно, с помощью такого подхода достигается высокая чувствительность и ПОР результата обследования при данной распространенности заболевания. С другой стороны, снижается специфичность и ППР обследования. Применение параллельного тестирования — одна из возможных причин, в силу которой в специализированных центрах часто диагностируют заболевания, не выявленные врачами поликлиник, но одновременно возникает тенденция к гипердиагностике.

Параллельно целесообразно использовать тесты, обладающие высокой специфичностью, но низкой чувствительностью, тогда каждый полученный положительный результат будет обладать большей достоверностью. В качестве примера можно привести параллельное использование в целях ранней диагностики ревматоидного артрита РФ и антител к циклическому цитруллиновому пептиду. При параллельном использовании нескольких тестов важна независимость их результатов друг от друга. В таком случае диагностический комплекс будет обладать наибольшей чувствительностью.

В случае последовательного назначения тестов целесообразно подразделять тесты на скрининговые и подтверждающие в зависимости от их лабораторных параметров. Скрининговые тесты должны обладать высокой чувствительностью и, соответственно, высокой негативной предсказательной ценностью. В свою очередь, подтверждающие тесты обладают высокой специфичностью и высокой позитивной предсказательной ценностью.

Последовательное назначение диагностических тестов целесообразно в клинических ситуациях, не требующих быстрой оценки состояния больного, например в амбулаторной практике. Последовательное назначение тестов значительно снижает общую стоимость тестирования, так как решение о выполнении тестов следующего уровня принимается после получения данных о результатах тестов предыдущего уровня. При последовательном назначении обследования повышается его ППР (т.е. специфичность такого подхода значительно выше). В итоге возрастает уверенность врача в том, что положительный результат теста подтверждает наличие заболевания, но одновременно возрастает риск пропустить заболевание. Последовательное назначение обследования особенно полезно в том случае, если ни один из тестов не обладает высокой специфичностью. Последовательно целесообразно назначать тесты, которые описывают один и тот же биологический феномен и результаты которых будут перекликаться между собой. Так, целесообразен последовательный алгоритм диагностики ДБСТ с помощью АНА, включающий тесты разных уровней.

На самом деле, ни один клинический или лабораторный тест не используется изолированно. Так, сбор анамнеза, терапевтический физикальный осмотр или назначение обследования позволяет получить большое число данных информации и обычно включает как параллельно, так и последовательно назначенные лабораторные тесты. Необходимость использования скрининговых панелей и подтверждающих тестов диктует необходимость применения диагностических алгоритмов, которые позволяют регламентировать целесообразность и объем дальнейшего обследования больного в зависимости от результатов скрининговых тестов.

Расчет аналитических параметров иммунологических тестов в ревматологии

Несмотря на четкость формулировок, аналитические параметры теста зависят от метода их определения, а проще говоря, от тех данных, которые используются для заполнения всех четырех полей таблицы для расчета чувствительности и специфичности. Без них невозможно оценить риск ошибочной диагностики, что является важнейшей характеристикой каждого теста. Но заполнить все четыре поля таблицы подчас бывает очень трудно, ведь объективные и надежные способы установления диагноза, даже если они теоретически существуют, иногда недоступны по этическим или практическим причинам. Существующий метод оценки аналитических параметров нового теста основан на сравнении его результатов с результатом некоторого точного способа определения болезни, условно называемого "золотым стандартом" или референтным тестом. Референтный тест почти никогда нельзя считать абсолютным. В лучшем случае мы можем выявить присутствие неотъемлемых признаков заболевания — например выделение культуры патогенного микроорганизма или наличия злокачественных клеток в материале биопсии.

При большинстве заболеваний, прежде всего хронических воспалительных и дегенеративных, такого однозначного теста не существует вообще или он сложен, дорог и небезопасен для пациента. Последняя ситуация наиболее типична для ревматических заболеваний, при которых этиологический агент обычно отсутствует, четких инструментальных критериев нет, а морфологическая картина представлена неспецифическим воспалением в органах-мишенях.

В соответствии с классическими представлениями клинический диагноз в ревматологии ставится на основании исключения других причин. Если методом исключения заболевание было отнесено к ревматическим, могут быть использованы классификационные критерии диагностики, основанные на наборе клинических, инструментальных и лабораторных тестов. В результате в ревматологии новый лабораторный иммунологический тест сопоставляется с классификационными критериями соответствующего ревматического заболевания.

Строго говоря, критерии диагностики аутоиммунных заболеваний, например СКВ, АФС или РА, представляют собой параллельно назначенные диагностические тесты. Учитывая, что основной целью их применения является классификация заболеваний, эти наборы тестов подбирались таким образом, чтобы обеспечить максимальную специфичность обследования. Например, несмотря на сравнительно большую специфичность, превышающую 95%, классификационные критерии диагностики СКВ, разработанные Американской ревматологической ассоциацией, характеризуются чувствительностью, не превышающей 75%. Это может привести к парадоксальной ситуации, когда более чувствительный новый диагностический тест сравнивается с уступающим ему по аналитическим параметрам "золотым стандартом".

Чувствительность многих иммунологических тестов непостоянна в зависимости от длительности заболевания и проводимой терапии. В дебюте ревматических заболеваний однозначный клинический диагноз ставится редко и для постановки окончательного диагноза требуется время, необходимое для проявления развернутой кпинико-лабораторной картины заболевания. Классификационные критерии не подходят для ранней диагностики и предназначены для выявления развернутых форм заболевания. Таким образом, в дебюте заболевания чувствительный диагностический тест может оказаться ложноположительным. В этом случае "золотым стандартом" диагностики становится длительное наблюдение за больным, которое позволяет убедиться в диагнозе. Например, при использовании серологических тестов для диагностики раннего ревматоидного артрита необходимо наблюдение за больными с впервые возникшим недифференцированным артритом, вплоть до развития всех клинических признаков ревматоидного артрита.

Иногда отсутствие проспективного наблюдения за пациентом может создать порочный круг. О достоверности лабораторного теста судят путем его сравнения с клиническим диагнозом, основанным на изучении анамнеза и данных физикального исследования. Затем сам тест используется для подтверждения клинического диагноза, установленного по данным анамнеза и физикального исследования. Одним из примеров подобного подхода в определенной степени может служить использование антифосфолипидных антител для диагностики тромбозов. Участие антифосфолипидных антител (АФЛА) в патогенезе тромбозов доказывается путем обследования больных с тромбозами различного генеза, диагноз которых уже установлен на основании клинических проявлений. В результате АФЛА используются для диагностики тромбозов и их клинического риска, не принимая во внимание низкую специфичность выявления данных аутоантител.

При анализе аналитических параметров диагностического теста зачастую искусственно занижается граница нормы при тестировании. Дело в том, что исследователи (или фирмы-производители реактивов) в погоне за высокой чувствительностью метода несколько занижают границы нормы. В то же время специфичность теста во многом зависит от группы контроля (т.е. лиц без заболевания или с заболеваниями, требующими дифференциальной диагностики). Так, если в группу контроля набрать исключительно здоровых лиц, — параметры специфичности будут крайне высоки, что позволит снизить границы нормы и, таким образом, добиться неправдоподобно высокой чувствительности обследования. Кроме того, если обследовать исключительно пациентов с обострениями аутоиммунного заболевания, то чувствительность выявления аутоантител будет несколько выше по сравнению с реальной популяцией больных, которые направляются на обследование обычно для выявления стертых форм заболевания.

Анализ отрицательных результатов теста не менее важен, чем положительных, и требует отдельного обсуждения. Сведения об информативности отрицательных результатов лабораторных тестов обычно отсутствует. Это связано с тем, что врачи полагают, что в интересах больного применение более подробного исследования оправдано только в том случае, если предварительные тесты дали положительный результат и пациенты с отрицательным результатом скрининговых тестов обычно подвергаются менее детальному обследованию, в результате чего частота ложноотрицательных результатов многих тестов окончательно не установлена. Учитывая крайне большое значение серологического тестирования в диагностике аутоиммунных заболеваний, частота серонегативных форм заболевания занижается и ее распространенность обнаруживается лишь при описании дополнительных диагностических маркеров.

Учитывая бурное развитие иммунологических технологий и появление новых диагностических показателей, для современного врача-клинициста важно представлять себе общую схему клинической апробации новых технологий, чтобы представлять преимущества и недостатки диагностических тестов. При разработке и клинической оценке любого нового лабораторного теста используется следующий алгоритм. После разработки диагностического метода, подбора компонентов тест-системы, тест калибруется с помощью стандарта, определяется его воспроизводимость и биологическая вариация, оценивается диапазон измеряемых значений. Далее, с его помощью исследуется биологический материал от клинически здоровых лиц. В качестве такой группы могут быть использованы доноры крови или другая немедицинская популяция, в которой распространенность заболевания низка (менее 1/1000). Ее обследование позволяет установить среднее значение и оценить вариацию данных. Вариация данных позволяет оценить условную границу нормы для обследованной популяции. Для большинства лабораторных тестов границы нормы рассчитываются исходя из двух стандартных отклонений от среднего значения, что позволяет включить 95% полученных значений.

Результаты иммунологических тестов в норме имеют значительную вариацию, поэтому для определения границ нормы используется 3-5 стандартных отклонений от среднего значения.

Со статистической точки зрения, для расчета интервала достоверности с помощью непараметрических тестов минимальный размер группы клинически здоровых начинается от 119 для подсчета 90% доверительного интервала для границ нормы, однако обычно для иммунологических тестов размер группы должен составлять не менее 200 человек.

Формальное состояние здоровья исследуемой популяции имеет меньшее значение, чем ее соответствие эпидемиологическим показателям того контингента, который будет обследоваться с помощью нового теста. В действительности высока опасность постановки некорректного диагноза, особенно если тест может быть ложноположительным у здоровых лиц, в определенной популяции, например, в пожилом возрасте. Так, встречаемость основных серологических маркеров ревматических заболеваний, таких как РФ и АНФ, у пожилых достигает 10-15%. Аномально высокие или низкие результаты обследования в определенных популяционных группах могут явиться причиной некорректного определения границ нормы, низкой специфичности обследования и, в итоге, причиной некорректного диагноза.

Для расчета показателей чувствительности и специфичности набираются группы пациентов с диагностированным заболеванием и группа контроля. Так как используемый тест будет применяться для решения конкретной клинической задачи, отбор групп должен напоминать конкретную клиническую ситуацию. Желательно оценивать тест для диагностики заболевания в разных группах, например у больных с дебютом заболевания, длительно текущим заболеванием, обострением или ремиссией заболевания.

Очевидно, что в разных группах пациентов тест может иметь разную чувствительность. Так, встречаемость РФ возрастает с увеличением длительности РА, а титры АНФ значительно выше при обострении СКВ. Если тест планируется использовать для дифференциальной диагностики, то в группу контроля должны быть включены больные с диагнозами, которые требуют дифференциальной диагностики, причем в пропорции, соответствующей частоте этих заболеваний в клинике. Соотношение численности групп с известным заболеванием и группой контроля должно соответствовать соотношению пациентов, которые направляются в лабораторию для дифференциальной диагностики. Желательно, чтобы соотношение составляло 1/10, что соответствует приблизительной частоте заболевания среди больных, направляемых на специфическое обследование при дифференциальной диагностике. Это соотношение может быть меньше, если тест оценивается для ранней диагностики заболевания.

Кроме того, ценным является определение частоты положительных результатов теста при других близких заболеваниях. Так, специфичность определения РФ при ревматоидном артрите будет зависеть от того, попали ли в контрольную группу больные с синдромом Шогрена или эссенциальной криоглобулинемией, у которых РФ отмечается даже чаще, чем при ревматоидном артрите. В результате некоторые тесты обладают низкой специфичностью для дифференциальной диагностики какого-то одного заболевания, но в целом являются специфичным маркером целой группы заболеваний. Так, АНФ является специфическим маркером диагностики системных аутоиммунных заболеваний вообще, однако для диагностики СКВ его специфичность низка.

Для подбора клинической нормы используется построение зависимости между чувствительностью и специфичностью. Определенный математический аппарат, анализирующий площадь под кривой этой зависимости, позволяет определить наилучшую границу, в зависимости от медицинских задач, которые предполагается решить.

Интерпретация результатов серологического обследования при ревматических заболеваниях

Целый ряд особенностей отличает методы обнаружения аутоантител от оценки содержания других молекул в биологических жидкостях, поэтому некоторые аспекты диагностического использования аутоантител требуют отдельного освещения.

Аутоантитела представляют собой иммуноглобулины классов IgG, IgА, IgМ, специфически связывающиеся с антигенными эпитопами молекул человеческого организма.

Появление аутоантител представляет собой нормальный биологический феномен, а связывание иммуноглобулинов с собственными антигенами можно выявить в сыворотке любого человека. В норме существует охарактеризованная популяция СD5+ В-клеток, синтезирующая полиреактивные низкоаффинные иммуноглобулины, способные связываться со многими антигенами. Роль аутоантител в норме и причина их появления изучены недостаточно. Вероятно, что причиной образования аутоантител является перекрестная реактивность иммуногенных эпитопов между антигенами инфекционных агентов и собственными молекулами организма. Спектр антигенных стимулов, окружающих человека, постоянно меняется, что ведет к образованию низкоаффинных непатогенных аутоантител.

Аутоантитела выявляются при инфекционных и онкологических заболеваниях, воспалительных процессах различного генеза, хронических интоксикациях (алкоголизме), либо на фоне приема лекарственных препаратов. Появление ревматоидного фактора при вирусном гепатите С, антимиокардиальных антител при вирусных миокардитах указывают на большое значение инфекции в генезе аутоиммунных процессов. Встречаемость антинуклеарных антител несколько возрастает у пациентов с онкологическими заболеваниями, причем индукция антинуклеарных антител на фоне опухоли указывает на лучший прогноз у онкологических больных. Встречаемость ряда аутоантител, в частности ревматоидного и антинуклеарного фактора, нарастает в пожилом возрасте. Однако титры аутоантител, присутствующих в норме, низки и сравнительно нестойки с течением времени.

Возможность использования конкретной разновидности аутоантител в качестве диагностического показателя определяется их встречаемостью при аутоиммунном заболевании. Встречаемость тех аутоантител, которые используются для клинической диагностики, обычно составляет более 60-70% при патологии, менее 1% в норме и при других заболеваниях. Хорошие клинико-лабораторные параметры многих разновидностей аутоантител позволяют рассматривать их в качестве лабораторных маркеров этих заболеваний, то есть высокоспецифичных лабораторных тестов, обладающих исключительной диагностической информативностью.

Высокоспецифичными серологическими маркерам называют те разновидности аутоантител, которые встречаются исключительно при этом заболевании. Так, к высокоспецифичным серологическим маркерам относят анти-ДсДНК и анти-Sm при СКВ, антитела к Scl-70 антигену при склеродермии. Аутоантитела могут одновременно быть высокоспецифичными маркерами нескольких групп заболеваний. Например, антитела к цитоплазме нейтрофилов отмечаются как при гранулематозных васкулитах, так и при воспалительных заболеваниях кишечника. Ряд аутоантител, характерных для аутоиммунных заболеваний, сравнительно часто отмечается у нормальных лиц без признаков аутоиммунного заболевания, что значительно ограничивает их диагностическое использование, например, клиническое использование антител к скелетным мышцам при миастении или антител к миокарду ограничено, так как они часто могут встречаться в норме либо при неиммунных заболеваниях.

Обычно появление высоких титров специфических аутоантител у клинически здоровых лиц может рассматриваться в качестве фактора риска развития аутоиммунного заболевания. Аутоантитела в сыворотке крови могут обнаруживаться за несколько месяцев до возникновения клинических проявлений заболевания. Так, при ревматоидном артрите антицитруллиновые антитела могут быть обнаружены за полтора года до дебюта артрита, обнаружение антинейтрофильных антител предваряет развитие гломерулонефрита на несколько месяцев.

Значение выявления аутоантител, применительно к конкретному случаю, зависит от титров содержания аутоантител в сыворотке обследуемого. Обычно высокое содержание антител указывает на высокую аффинность последних. Это, в свою очередь, характеризует специфичность и выраженность иммунного ответа. Обнаружение высоких титров антител обычно указывает на аутоиммунное заболевание, в то время как низкие титры часто отмечаются в норме и не специфичны. В отсутствии иммуносупрессивного лечения при аутоиммунных заболеваниях содержание аутоантител обычно сохраняется высоким длительное время. В случае появления антител на фоне инфекции или неиммунного воспаления титры антител обычно нестойки и подвержены значительным колебаниям.

Аутоантитела могут быть индуцированы воспалительным, инфекционным, онкологическим процессом или спровоцированы назначением определенных препаратов. Для того чтобы отличить транзиторную индукцию аутоантител от хронического их присутствия при аутоиммунном заболевании, может потребоваться повторное обследование.

Учитывая, что время полужизни сывороточных иммуноглобулинов составляет около 3 месяцев, минимальное время между повторными обследованиями должно превышать полгода.

В то же время продукция аутоантител при аутоиммунных заболеваниях не является постоянной величиной. Встречаемость аутоантител может нарастать с увеличением длительности аутоиммунного заболевания, как это происходит при ревматоидном артрите, или снижаться ниже порога детекции в течение первого года заболевания при сахарном диабете. Аутоантитела синтезируются в составе нормального пула иммуноглобулинов сыворотки крови плазмоцитами костного мозга, лимфатических узлов и селезенки, однако в ходе иммунного ответа при аутоиммунном процессе продукция антител в очаге воспаления может приобретать особые характеристики, например, может измениться тональность иммуноглобулинов. Так, при рассеянном склерозе отмечается выраженное увеличение местного синтеза антител и иммунный ответ в ликворе становится олигоклональным, а при смешанной криоглобулинемии в состав криоглобулинов сыворотки входит моноклональный ревматоидный фактор.

Хотя большинство аутоантител являются свидетелями аутоиммунного воспаления и их содержание не коррелирует с активностью заболевания, обнаружение определенных типов аутоантител при ревматических заболеваниях указывает на характерные особенности клинического течения. Так, у пациентов, имеющих в сыворотке специфический набор антител, наблюдается особенное течение заболевания, отличное от симптоматики больных, не имеющих этих антител. При СКВ, сопровождающейся антителами к Rо/SS-А, гломерулонефрит встречается реже, чем у больных, имеющих высокий титр антител к дсДНК, но имеется определенный риск развития поражений кожи и предрасположенность к повышенной фоточувствительности. Поэтому определение АНА позволяет врачу предсказать, а иногда и предотвратить развитие осложнений.

Динамика титра определенных видов антител в ходе заболевания имеет прогностическое значение. Увеличение концентрации антител к дсДНК предшествует вспышке СКВ, и ранняя патогенетическая терапия может уберечь больного от развития клинических проявлений или уменьшить их остроту, что улучшает прогноз при этом заболевании.

Выделение больных с тем или иным типом аутоантител в отдельную, часто клинически гомогенную, группу подтверждается обнаружением определенного НLА генотипа у больных с конкретным типом АНА. Так, например, пациенты с дерматомиозитом, у которых в сыворотке крови обнаруживаются антитела к Jо-1, характеризуются исключительно НLА-DRЗ (DRw17) и НLА-DRw52 генотипом.

Таким образом, исследование содержания аутоантител и их спектра указывают на особенности функционирования иммунной системы и отражают ее особую предрасположенность к формированию аутоиммунного ответа. Благодаря единому патогенетическому механизму индукции аутоантител, конкретные разновидности аутоантител могут быть сгруппированы в семейства, реагирующие с мишенями одного рода. Например, все представители семейства антинуклеарных антител реагируют с рибонуклеопротеиновыми антигенами ядер; аутоантитела, относящиеся к семейству антинейтрофильных цитоплазматических антител, реагируют с набором антигенов, локализованных в азурофильных гранулах цитоплазмы нейтрофилов. Каждая разновидность аутоантител, даже направленная к одному антигену, представляет собой поликлональную популяцию антител, представленную молекулами иммуноглобулинов с разными физико-химическими свойствами. Это обусловлено тем, что поликлональные антитела реагируют с разными эпитопами на поверхности молекулы антигена, причем сила связи каждой молекулы антитела с антигеном (аффинность) различна. Естественно, что в идеале иммунологический лабораторный метод должен выявлять не одну разновидность молекул, как это происходит в большинстве традиционных лабораторных тестов, а целый спектр аутоантител, направленных на разные антигены, причем каждое антитело значительно отличается от других по заряду, молекулярной массе и силе связывания с антигеном, которая зависит от условий реакции. Такого идеального метода не существует.

На практике для точного описания спектра аутоантител, присутствующих в биологической жидкости, используется несколько методов, каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки. В итоге интерпретация результатов исследования одного лабораторного показателя зависит от метода, с помощью которого он определен.

Особенности обнаружения аутоантител приводят к тому, что один тест может иметь до 10 вариантов ответа, включающих наличие аутоантитела, его титр, а также несколько разнообразных типов связывания антител с субстратом. Обычно на первом этапе тестирования используется метод, обладающий максимальной чувствительностью, в котором присутствует максимально широкий спектр антигенов. Уточнение специфичности обнаруженных аутоантител возможно при использовании подтверждающих тестов, назначенных по результатам первичного тестирования.

Еще одной особенностью практического выявления аутоантител, вытекающей из биологической природы этого феномена, является то, что не существует абсолютно корректного подхода к измерению содержания аутоантител. Дело в том, что большинство иммунологических тестов построены на связывании аутоантитела и антигена-мишени. Результат теста зависит как от физической концентрации аутоантител, так и от аффинности аутоантитела и антигена. При аутоиммунных заболеваниях специфические антитела синтезируются в высокой концентрации и обычно обладают большой аффинностью. Однако большая концентрация низкоаффинных аутоантител может дать сигнал более сильный, чем малая концентрация высокоаффинных специфических аутоантител. Так, у больных с СКВ, у которых в результате поликлональной активации В-клеток синтезируется большое количество полиспецифичных антител, наблюдаются ложноположительные реакции в серологических тестах для обнаружения антител к вирусу гепатита С. В то же время при волчаночном нефрите с нефротическим синдромом в результате неселективной протеинурии утрачивается сывороточный IgG. В результате при низком содержании IgG тесты по выявлению аутоантител могут быть ложноотрицательны. Низкоаффинные антитела, как было указано выше, нередко приводят к ложноположительным результатам анализов.

Обнаружение неспецифического и перекрестного связывания аутоантител в некоторых иммунологических тестах, обнаружение низких титров аутоантител в норме нередко требует выделения "серой зоны" или "зоны сомнительных результатов".

В случае обнаружения невысоких титров аутоантител, которые могут быть обусловлены неспецифическим связыванием аутоантител или присутствием специфических серологических маркеров, но в низкой концентрации, интерпретация результата зависит от постановки клинической задачи. Если речь идет об исклюении ревматической природы заболевания в дифференциальной диагностике неревматической патологии, то результат может быть интерпретирован как отрицательный. В случае, если тест используется для подтверждения ревматического заболевания у больного с другими клиническими признаками ревматической патологии, результат теста должен рассматриваться как положительный.

Несмотря на определенные трудности в интерпретации результатов иммунологического обследования, а также большой объем информации, который необходимо принимать во внимание при анализе результатов обследования, информативность иммунологических тестов очень высока. Особенности постановки диагностической задачи и планирования иммунологического обследования приведены в табл. 2.

Таблица 2. Постановка и решение диагностических задач с помощью иммунологической диагностики
Клинический вопрос	Диагностическая задача	Назначение обследования
Как исключить диагноз?	Ранняя диагностика и оценка риска	Скрининговый тест, обладающий высокой чувствительностью
Как подтвердить диагноз?	Дифференциальная диагностика	Подтверждающий тест, обладающий специфичностью
Границы нормы и патологии?	Классификация заболевания	Устанавливаются индивидуально на основе опыта лаборатории и результатов контроля качества
Что значит для больного результат обследования?	Прогноз исхода заболевания	Данные литературы при анализе больших когорт больных
Как часто повторять тест?	Контроль терапии	Учитывать время клиренса исследуемых молекул

Планирование серологического обследования зависит от клинической задачи, которую требуется решить клиницисту. В свою очередь назначение конкретных тестов зависит от их клинико-лабораторных параметров. Для скрининга используются тесты, отрицательный результат которых с большой вероятностью позволяет исключить заболевание, то есть тесты, которые имеют наибольшее значение ПОР. Обычно такими параметрами обладают методы, которые позволяют одновременно выявлять антитела к антигенам одного семейства. Так, назначение антинуклеарного фактора целесообразно на этапе скрининга ревматических заболеваний, так как обычно диффузные заболевания соединительной ткани сопровождаются выявлением антинуклеарных антител. Отрицательный результат выявления АНФ делает диагноз СКВ или системной склеродермии маловероятным.

Часто уже на этапе скрининга необходимо назначать комбинации тестов, параллельное использование которых значительно снижает вероятность ошибочного исключения диагноза. Так, в диагностике ревматоидного артрита, учитывая низкие клинико-диагностические параметры выявления РФ и антицитруллиновых антител в дебюте этого заболевания, рационально назначать панель тестов, включащую как РФ, так и антицитруллиновые антитела.

Дифференциальная диагностика требует назначения тестов, обладающих большей специфичностью. Так, при обнаружении низких титров АНФ, выявление антител к дсДНК указывает на диагноз СКВ. В той же ситуации обнаружение высокого содержания РФ или антител к цитруллиновым антигенам указывает на РА.

Не менее важен вопрос о результатах тестов, которые находятся в "серой зоне". В случае скринингового теста результат, находящийся в "серой зоне", следует интерпретировать как неспецифический, в то время как у пациента с уже определенным диагнозом тот же результат следует отнести к низкой, но значимой концентрации аутоантител.

При решении задач дифференциальной диагностики комбинации тестов делают результат обследования более убедительным. Так, диагностика антифосфолипидного синдрома с помощью антифосфолипидных антител должна расширяться за счет параллельного обследования для диагностики СКВ. Хотя литературных данных, указывающих на необходимость широкого скрининга аутоантител в клинике немного, однако существуют исследования, свидетельствующие, что расширение спектра назначений значительно увеличивает число диагностических находок при аутоиммунных заболеваниях. Так, по данным фирмы "Euroimmun" (Германия), исследование сывороток, направленных в клиническую иммунологическую лабораторию для выявления конкретной разновидности аутоантител, на широкую панель аутоантител, включающую маркеры распространенных аутоиммунных заболеваний, практически удваивает число диагнозов. Среди аутоантител, которые обнаруживаются чаще всего, лидирует АНФ. По нашему собственному опыту, комбинированное тестирование, несомненно, улучшает информативность обследования пациентов. Комбинированное тестирование, включающее параллельный скрининг разных аутоиммунных заболеваний, имеющих общие черты, крайне информативно при дифференциальной диагностике "системных" ревматических заболеваний.

1   2   3   4