За сравнительно короткое для истории медицины время, прошедшее с июня 1981 г., когда социалисты Центра по контролю за болезнями (Атланта, США) обратили особое внимание на сведения о 5 больных с пневмоцистной пневмонией и кандидозом [20], был выполнен беспрецедентно большой объем научных исследовании по проблеме ВИЧ-иифекции, предложены эффективные методы лабораторной диагностики. Однако до настоящего времени диагностика ВИЧ-инфекции зачастую представляет определенную трудность.

Учитывая, что СПИД считают болезнью со 100%-ной летальностью, а также настороженную общественную ориентацию к ВИЧ-инфицированным, установление такого серьезного диагноза налагает особую ответственность на врачей за психоэмоциональное состояние, социальную адаптацию, а порой и за жизнь больного (инфицированного).

Основной задачей лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является как можно раннее выявление первичной инфекции в целях:

• защиты реципиентов крови, органов и тканей;
• назначения и проведения противовирусной терапии;
• проведения противоэпидемических мероприятий.

Незнание этиологии, патогенеза, клинического течения заболевания затрудняет интерпретацию результатов клинико-лабораторных исследований. Проблема лабораторной диагностики ВИЧ-нмфекции усугубляется несовершенством диагностических тест-систем, обусловленным с одной стороны технологическими трудностями, с другой - высокой генетической изменчивостью вируса и схожестью антигенного состава ВИЧ и некоторых структур организма человека.

ЭТИОЛОГИЯ

Возбудитель ВИЧ-инфекции - вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). ВПЧ поражает клетки иммунной и нервной систем, что клинически проявляется развитием лимфаденопатии, инфекционных (паразитарных) осложнений, возникновением некоторых злoкачественных новообразований, а также энцефало/миелопатни [8]. Заболевание было впервые описано и получило название по ведущему синдрому - синдрому приобретенного иммунодефицита (СПИД). Позднее стало известно, что СПИД является конечной фазой клинического течения ВИЧ-инфекцпи.

Источником ВИЧ-инфекцпи является человек. Вирусные частицы обнаружены во многих биологических жидкостях инфицированных - в крови, сперме, цереброспинальной жидкости, грудном молоке, влагалищном и цервикальном секретах. Это обусловливает несколько путей передачи ВИЧ-инфекции. ВИЧ может передаваться при половых контактах, переливании крови и ее препаратов, использовании контаминированного медицинского инструментария, от матери к ребенку и от ребенка матери во время кормления грудью, а также от матери ребенку во время беременности и родов [10].

ВИЧ относится к семейству ретровирусов и подсемейству лентивирусов(рис. 9.1). Члены семейства ретровирусов характеризуются содержанием геномной РНК и фермента обратная транскриптаза (ревертаза). Для того, чтобы геном ретровнруса соединился с геномом клетки, вначале с помощью обратной транскриптазы происходит синтез ДНК по матрице вирусной РНК. Затем ДНК провируса встраивается в геном клетки-хозяина.

История открытия ВИЧ

ВИЧ был открыт почти одновременно в 1983 г. независимо друг от друга двумя исследователями - Р. Галло (Национальный институт рака, США) и Л.Монтанье (Институт Пастера, Франция).

Р.Галло в 1980 г. открыл первый ретровирус человека. Вирус поражал Т-клетки крови, вызывая лейкоз, и получил соответствующее название - человеческий Т-клеточный вирус лейкемии, Human Т-сеll Leukemia Virus (HTLV). Следующим в лаборатории Р. Галло был выделен ретровирус НТLV-II, который вызывает хронический волосатоклеточный Т-лейкоз.

Новое инфекционное заболевание СПИД, не известное до 1981 г., сопровождалось истощением пула Т-лимфоцмтов, что и натолкнуло Р. Галло на мысль о связи данной болезни с неизвестным Т-лимфотропным вирусом. Исследования, в результате которых был выделен НТLV-III, подтвердили гипотетические предположения ученого.

В лаборатории Л.Монтанье новый вирус был выделен от больного с синдромом лимфаденопатии и назван вирусом, ассоциированным с лимфаденопатией,- Lymphadenopathyassociated Virus (LAV)). После того как было установлено, что НТLV-III и LAV являются одним и тем же вирусом, был утвержден единый термин - вирус иммунодефицита человека, ВИЧ (Human Immunodeficiency Virus, HIV). Однако в названиях коммерческих тест-систем для определения антител к ВИЧ иногда встречаются прежние обозначения вируса.

Строение ВИЧ

ВИЧ включает две основные структуры - оболочку и нуклеоид/нуклеокапсид (сердцевинную часть) (рис. 9.2). Оболочка вируса представляет собой фрагмент мембраны (наружной или эндоплазматического ретикулума) клетки-хозяина, в которой был собран вирион. Липидный слой несет в себе гликопротеин gp160* (* Латинские буквы gp обозначают глпкопротеин, а число соответствует молекулярной массе белка в килодaльтонах, кДа), состоящий из экимембранной (наружной) части, обозначаемой gр120, и трансмембранной части - gр41. Трансмембранный протеин gр41, расположенный непосредственно в оболочке вируса, соединяется дисульфидными связями с несколькими (от 3 до 6) молекулами gр120. Некоторое количество гликопротеина gр120 произвольно отделяется от вириона и попадает в кровь и ткани организма в виде растворимой субстанции.

Внутри под оболочкой находится матриксный каркас, состоящий из белка p17/18** (** Латинская буква p обозначает протеин. Через знак "/" перечислены значения молекулярной массы белка по данным различных литературных источников. Далее в тексте будут приведены наиболее часто употребляемые в практике значения).

Нуклеоид ВИЧ имеет характерную для ретровирусов форму палочковидной или конической капсулы. Стенка нуклеоида состоят из белка р24/25. Сердцевина вириона содержит две одно-цепочные молекулы РНК, с которыми связаны белки р7 и р9, а также комплекс ферментов: обратную транскриптазу (ревертазу), интегразу (эндонуклеазу), РНКазуН и протеазу.

Сотрудникам Л.Монтанье в 1986 г. удалось выделить вариант вируса иммунодефицита человека от двух африканцев с заболеванием, подобным СПИД. Вирус не распознавался антителами к ВИЧ, поэтому был обозначен как ВИЧ-2. Уже через два года заболевание, вызываемое ВИЧ-2, было выявлено на других континентах. Оно характеризуется большей длительностью бессимптомного периода по сравнению с инфекцией ВИЧ-1.

Строение ВИЧ-2 идентично строению ВИЧ-1. Однако большая часть структурных белков различается по молекулярной массе и антигенной характеристике. Так, например, поверхностный эпимембранный и трансмембранный гликопротеины имеют иную молекулярную массу, чем gp120 и gр41, и обозначаются gp105/125* (* В работах некоторых авторов эпимембранный гликопротеин gр105 обозначается как gp125) и gр36 соответственно. К рецепторным белкам клеток-мишеней gp105 имеет такое же выраженное сродство, как и gp120. Нуклеокапспд ВИЧ-2 состоит из белка р26, а матриксный каркас - из протеина р16.

Геном ВИЧ

Геном ВИЧ-1 представлен тремя крупными структурными и семью небольшими регуляторными генами (рис. 9.3). Гены с обеих сторон полинуклеотидной цепи ограничены так называемыми длинными концевыми повторами - long terminal repeat (LTR). Длинные концевые повторы представляют собой участки ДНК, которые содержат ряд важных регуляторных фрагментов. К ним относятся места связывания факторов, влияющих на процесс транскрипции: участок (сайт), с которого начинается транскрипция - информационной РНК с ДНК провируса, и нуклеотидные последовательности, необходимые для запуска (промотер), усиления (энхансеp) и торможения (элемент негативной регуляции) транскрипции. Таким образом, LTR выполняет ключевые регуляторные функции, обеспечивая и контролируя начало и темп репликации вируса.

Структурные гены кодируют белки, которые непосредственно входят в структуру вириона или являются ферментами. К ним относятся гены, обозначаемые env, gag и pol.

• Ген env (от англ. envеlоре - оболочка) [показать] .

  кодирует трансляцию белка молекулярной массой 160 кДа, который является предшественником гликопротеинов оболочки вируса - gр41 и gp120.

• Ген gag (от англ. group specific antigens - группо-специфичные антигены) [показать] .

  кодирует синтез белка р55, являющегося предшественником четырех внутренних белков вируса - р24 (нуклеокапсид), р17 (матрнксный каркас), р7 и р6. Протеин р7 связан с геномной РНК вируса, необходим при сборке вириона для заключения РНК в нуклеокапсид.

  Белок р6 обеспечивает высвобождение дочерних вирнонов из клетки-хозяина.

• Ген pol (от англ. polymerase - полимераза) [показать] .

  кодирует синтез протеазы (р52/53), которая расщепляет белок-предшественник р55 (gag), и еще трех других ферментов - обратной транскриптазы (ревертазы) (р64/66/68). РНКазы Н (р15), которая отделяет молекулу РНК из комплекса комплементарных цепей РНК+ДНК, образующегося в процессе обратной транскрипции, и интегразы (р31/32), которая обеспечивает интеграцию ДНК провируса в геном клетки-хозяина.

  Все 4 фермента, как указывалось выше, сосредоточены в нуклеокапсиде вириона.

Ниже приведены краткие сведения о регуляторных генах ВИЧ-1, продукты которых регулируют или обеспечивают процессы, связанные с репликативным циклом вируса в клетке.

• Ген tat (от англ. transactivator of transcription - трансактиватор транскрипции) [показать] .

  Состоит из двух пространственно разделенных участков, ответственен за активацию транскрипции генов провируса. Tat получил название трансактиватора, поскольку воздействует на гены, расположенные не в непосредственной близости от него. Ген tat кодирует синтез так называемого трансактивирующего фактора - белка с молекулярной массой около 14 кДа, обнаруживаемого в ядре и в цитоплазме пораженных ВИЧ клеток.

  Данный белок необходим для полноценного биосинтеза вирусной РНК, способен повышать синтез вирусных белков более чем в 1000 раз на этапах как транскрипции, так и трансляции. Tat действует как на гены провируса, так и на гены человека, являясь фактором роста для клеток саркомы Капоши.

  Увеличение синтеза вирусных белков, возникающее в результате действия продуктов гена tat стимулирует продукцию самого трансактивируюшего фактора, что, в свою очередь, по механизму положительной обратной связи приводит к еще более интенсивной продукции вирусных белков и сборке новых вирионов.

• Ген rev (от англ. regulator of virus - регулятор вируса) [показать] .

  кодирует синтез белка с молекулярной массой около 19 кДа, который локализуется в ядрах инфицированных клеток.

  Присутствие белка ускоряет процесс транспорта вирусной информационной РНК из ядра в цитоплазму.

• Ген nef (от англ. negative regulatory factor - негативный регуляторный фактор) [показать] .

  кодирует синтез белка с молекулярной массой 24-25/27 кДа, который имеет сродство к участку длинного концевого повтора - негативному регуляторному элементу (negative regulatory element, NRE). Взаимодействие белка nef и NRE приводит к подавлению транскрипции мРНК, и, как следствие, к снижению синтеза вирусных белков.

• Функция белка с молекулярной массой 23 кДа - продукта гена vif (от англ. viral infectivity factor - фактор инфекционной способности вируса)- окончательно не установлена. Полагают, что названный белок повышает инфекционную способность новообразованных вирионов.
• Регуляторный ген vpr (от англ. virus protein K - вирусный белок К) [показать] .

  кодирует синтез белка с молекулярной массой 15 кДa. Данный протеин обеспечивает активирующую функцию длинного концевого повтора (LTR), входит в состав дочерних вирионов и осуществляет активацию транскрипции с геномной РНК после внедрения вируса в клетку.

• Значение регуляторного гена vpl (от англ. virus protein T - вирусный белок Т) не установлено.
• Регуляторный ген vpu (от англ. virus protein U - вирусный белок U) [показать] .

  кодирует синтез белка молекулярной массой 16 кДа. Данный протеин играет роль в сборке вирионов и отделении их от клетки-хозяина.

Существование генных механизмов как активации (гены tat, rev), так и торможения (ген nef) репликативного процесса ВИЧ обеспечивает состояние функционального равновесия, при котором провирус может находиться в неактивной форме.

Геном ВИЧ-2 сходен по строению с геномом ВИЧ-1 (рис. 9.4). Различие геномов состоит в том, что у ВИЧ-2 нет регуляторного гена vpu, но имеется отсутствующий у ВИЧ-1 регуляторный ген vpx, расположенный в геноме провируса аналогично гену vpu. Гомология нуклеотидных последовательностей генов ВИЧ первого и второго типа равна приблизительно 50%.

Изменчивость ВИЧ

Изменчивость ВИЧ связана с неточностью работы обратной транскриптазы во время синтеза ДНК провируса. По различиям в нуклеотидных последовательностях гена env и соответственно в аминокислотных последовательностях gp120 варианты ВИЧ делятся на три группы: М (major), О (outline) и N (non М and О).

Наибольшей вариабельностью отличается участок молекулы gp120, образующий петлеобразный домен (т.н. V3-петля из 35 аминокислот). 80-95% противовирусных антител специфичны именно к этому участку.

Основная группа М (от англ. major - основной) на сегодня доминирует в мире [2]. Она и свою очередь подразделяется на субтипы, обозначаемые буквами латинского алфавита от А до H. Варианты ВИЧ этой группы встречаются во всех странах. География распространения субтнпов следующая. В Африке - колыбели ВИЧ - выявлены все субтипы. В Европе и Северной Америке превалирует субтип В, в Юго-Восточной Азии - субтип Е, в Индии - субтип С. В целом в мире наблюдается следующая частота выделения субтипов ВИЧ у инфицированных лиц (рис. 9.5).

Во всех регионах мира обнаруживаются так называемые рекомбинантные субтипы, содержащие часть генов одного субтипа и часть другого. Так в России основным субтипом ВИЧ является А, но встречаются рекомбинанты А+В.

Значительные генетические отличия от представителей основной группы имеет группа штаммов О (от англ. outline) [23]. Случаи инфицировании штаммами ВИЧ-0 имеют место на территории Западной Африки, их число пока невелико. Вместе с тем ряд ведущих фирм-производителей иммуноферментных тест-систем для определения антител к ВИЧ включают в состав наборов и антигены ВИЧ-О, так как вполне вероятно быстрое распространение данного субтипа вируса за пределы Африки.

ВИЧ-2 также имеет несколько субтипов.

Определение субтипов ВИЧ осуществляется методами молекулярной биологии - полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методом bДНК, основанным на использовании разветвленных ДНК-зондов (branch DNA - разветвленная ДНК). Методом bДНК возможно количественное определение РНК ВИЧ и ДНК провируса ВИЧ, причем всех 5 основных субтипов.

Коммерческие наборы, предназначенные для определения РНК ВИЧ методом ПЦР, рассчитаны для выявления всех типов ВИЧ кроме D.

Генетическая изменчивость проявляется в вариабельности не только антигенных, но и биологических свойств изолятов вируса.

Страница 1 2 3 4 5 6 7 8

всего страниц: 8

ЛИТЕРАТУРА [показать] .

Источник: Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, Интермедика, 2001