ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Наиболее иммуногенным из 5 основных антигенов группы крови системы резус (табл. 18.3) является антиген D. Распространенность антигена D у населения Российской Федерации - 86% (доля резус-отрицательных лиц, соответственно, около 14%). Иммуногенность других (минорных) антигенов системы резус существенно ниже и убывает в следующем ряду: с > Е > С > е.

Иммунная система резус-отрицательных лиц при контакте с антигеном D синтезирует анти-D-антитела, что клинически важно при аллогенных гемотрансфузиях и беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом (посттрансфузионные гемолитические реакции и гемолитическая болезнь новорожденных, соответственно). В зависимости от гаплотипа на мембране эритроцитов обычно экспрессировано 10000-30000 молекул D, а в некоторых случаях и более.

Существует две особые категории D-позитивных лиц, способных образовывать анти-D-антитела.

• Первая - лица, эритроциты которых характеризуются значительно сниженной экспрессией нормального D на мембране, порядка 100-500 молекул на клетку, "слабый" D (D^weak). Референтным методом выявления слабого D является непрямой антиглобулиновый тест.
• Вторая - лица, эритроциты которых характеризуются экспрессией измененного D (частичный D, D^partial). Предполагается, что белковая молекула D имеет четыре частично перекрывающихся эпитопа: W, X, Y и Z. В редких случаях имеет место недостаток одного или нескольких эпитопов, соответственно, иммунная система лиц с частичным D способна вырабатывать антитела к отсутствующим эпитопам.

По современной классификации, лица с частичным D, способные вырабатывать анти-D-антитела, подразделяются на семь категорий. Наибольшую частоту встречаемости и практическое значение имеет категория VI, эритроциты которой несут только эпитоп Z. Лица категории VI могут вырабатывать антитела к неизмененному D и частичному D всех остальных категорий. Современный подход к выявлению частичного D категории VI предполагает исследование резус-принадлежности с использованием двух реагентов: моноклональных анти-D-антител класса IgМ и поликлональных анти-D-антител класса IgG (либо моноклональных анти-D-антител класса IgG).

Для удобства в повседневной работе иммуногематологических лабораторий слабые варианты антигена D объединяют в группу D^u, частота которой составляет около 1%. Эти эритроциты слабо или вообще не агглютинируются полными анти-резус антителами в реакции прямой агглютинации.

Регламентированным является способ определения резус-принадлежности с использованием стандартного универсального реагента антирезус Rh0(D), первично отрицательные образцы дополнительно исследуются с использованием стандартного универсального реагента анти-Rh0" (DС) и со стандартной сывороткой Rh0-(DСЕ). Резус-отрицательными считают доноров, кровь которых не содержит ни одного из этих трех антигенов (D, С, Е). Указанный способ эффективно и широко использовался до разработки диагностикумов на основе моноклональных антител.

Более обоснованным представляется двух-этапный способ определения резус-принадлежности крови. На первом этапе используют цоликлон "Анти-D-супер" (моноклональные анти-D-антитела класса IgМ). На втором этапе резус-принадлежность определяют в пробирке, применяя стандартный универсальный реагент для определения резус-фактора Rh0(D), либо в желатиновом тесте с использованием цоликлона "Анти-D" (моноклональные анти-D-антитела класса IgG). Сочетание отрицательного результата на первом этапе и положительного - на втором является признаком частичного D, наиболее вероятно - категории VI.

В большинстве (порядка 90%) случаев для частичного D категории VI характерен генотип СсDее. С помощью высокоспецифичных моноклональных антител устанавливается гетерогенность частичного D категории VI.

Реципиенты, содержащие антиген D^u, должны быть отнесены к резус-отрицательным и им должна быть перелита только резус-отрицательная кровь, так как нормальный антиген D может вызвать у таких лиц иммунный ответ.

Лица с антигеном D^u квалифицируются как резус-положительные доноры, так как переливание их крови может вызвать иммунный ответ у резус-отрицательных реципиентов, а в случае предшествующей сенсибилизации к антигену D - тяжелые трансфузионные реакции. Поэтому кровь доноров следует обязательно тестировать на присутствие D^u.

Беременным женщинам с частичным D категории VI, когда ожидается рождение ребенка с полным D, целесообразно назначение антирезусного иммуноглобулина.

Резус-принадлежность крови больных устанавливают по наличию или отсутствию антигена D. Во избежание ошибки процедуру взятия крови и определение резус-принадлежности проводят дважды. Определение минорных антигенов системы резус, как правило, производится при необходимости многократных трансфузий в тех случаях, когда в сыворотке реципиента обнаружены антитела к антигенам системы резус, а также у беременных женщин.

Результат определения резус-принадлежности крови больных регистрируется в специальном журнале и на бланке с указанием даты и за подписью врача, проводившего определение. Этот бланк вклеивается в историю болезни с указанием даты и подписью лечащего врача.

Результат определения резус-принадлежности крови доноров регистрируется в специальном журнале и в донорской карте с указанием даты и за подписью врача, проводившего определение.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ

Реакция гемагглютинации на плоскости с помощью анти-D IgМ (полные антитела) моноклонального реагента

Определение производят в нативной крови, стабилизированной с помощью консервантов; в крови без антикоагулянта, в т. ч. взятой из пальца. Наиболее четкая реакция агглютинации наблюдается при использовании высокой концентрации эритроцитов и температуре около +37°С, поэтому желательно использовать подогретую пластинку.

Ход определения:

• на пластинку со смачиваемой поверхностью наносят большую каплю (около 0,1 мл) реагента;
• рядом помещают маленькую каплю (0,01-0,05 мл) исследуемой крови;
• смешивают кровь с реагентом стеклянной палочкой;
• через 10-15 с покачивают пластинку в течение 20-30 с;
• реакция агглютинации начинает развиваться через 10-15 с, четко выраженная крупнолепестковая агглютинация наступает через 30-60 с. Результат агглютинации следует учитывать через 3 мин, поскольку с эритроцитами, несущими антиген D^u, реакция агглютинации происходит медленнее.

  Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии в исследуемых эритроцитах антигена D (кровь - резус-положительная). Отсутствие агглютинации свидетельствует о том, что исследуемые эритроциты не содержат антигена D (кровь - резус-отрицательная). В случае слабой агглютинации делают предположение о наличии на эритроцитах слабого антигена D и проводят исследование фенотипа эритроцитов в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямой пробе Кумбса) с использованием IgG (неполных) анти-D-антител.

• сразу же после определения записывают результаты реакции.

Определение слабых форм антигена D (D^u) на втором этапе исследования реакцией конглютинации с желатином в пробирочном тесте с помощью анти-D IgG (неполные антитела) моноклонального реагента

Параллельно с исследованием осуществляют постановку трех контрольных проб:

• а) со стандартными резус-положительными эритроцитами;
• б) со стандартными резус-отрицательными эритроцитами;
• в) с исследуемыми эритроцитами и раствором желатина, но без анти-D-антител.

Ход определения:

• в пробирку вносят одну каплю (0,05 мл) свободных эритроцитов из сгустка свернувшейся крови или эритроцитов, отмытых от консерванта;
• добавляют 2 капли (0,1 мл) 10% желатина, предварительно прогретого при 45-50°С до разжижения;
• добавляют одну каплю реагента анти-В;
• перемешивают суспензию;
• инкубируют 10-15 мин в водяной бане или 30 мин в термостате при 48°С;
• прибавляют 5-6 мл физиологического раствора;
• осторожно переворачивают пробирку 1 - 2 раза;
• визуально (невооруженным глазом или используя лупу) определяют наличие агглютинатов.

Агглютинация эритроцитов свидетельствует о присутствии в них антигена D. В случае четкой агглютинации в образце крови, резус-отрицательной по результатам исследования с помощью анти-D IgМ моноклональных антител, делают заключение о наличии антигена D^u. В случае нечеткой мелкопесочной агглютинации кровь необходимо тестировать в непрямом антиглобулиновом тесте.

Аналогичным образом наряду с моноклональными реагентами можно использовать стандартные аллоиммунные сыворотки с неполными анти-D-антителами.

При наличии неадекватных результатов контрольных проб определение резус-принадлежности следует повторить с использованием других реагентов или образца желатина. При агглютинации исследуемых эритроцитов желатином в отсутствие анти-D-антител можно предположить наличие на эритроцитах адсорбированных антиэритроцитарных антител анти-резус или иной специфичности.

Определение резус-антигенов с помощью универсальных реагентов

Стандартный реагент антирезус Rh0(О) содержит поликлональные неполные анти-D-антитела. Одновременно с исследованием крови доноров производится контрольное исследование стандартных резус-положительных эритроцитов той же группы или группы 0(I) и стандартных резус-отрицательных эритроцитов обязательно одногруппных с исследуемой кровью.

Ход определения:

• на дно пробирки вносят 1 каплю стандартного реагента антнрезус;
• добавляют каплю исследуемой крови (или эритроцитов);
• содержимое пробирки перемешивают встряхиванием;
• медленно поворачивают пробирку, наклоняя ее почти до горизонтали таким образом, чтобы содержимое растекалось по стенкам. Такое распределение крови по стенкам пробирки делает реакцию более выраженной;
• агглютинация наступает в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген-антитело и четко выраженной агглютинации, а также ввиду возможности замедленной реакции при наличии антигена D^u, контакт эритроцитов с реагентом при перевертывании следует проводить не менее 3 мин;
• для исключении неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают, не взбалтывая, путем 2-3 -кратного перевертывания пробирки;
• оценку производят визуально.

Наличие агглютинации в виде крупных хлопьев из эритроцитов на фоне просветленной жидкости свидетельствует о резус-положительной принадлежности исследуемой крови.

Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная жидкость) - признак резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.

Результат учитывается как истинный после проверки контрольных образцов, то есть при положительном результате со стандартными резус-положительными эритроцитами и отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, одногруппными с исследуемой кровью по системе АВО.

Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса) с помощью (неполных) анти-D-антител

Параллельно с исследованием образцов тестируемой крови проводят контрольное исследование со стандартными резус-отрицательными эритроцитами.

Ход определения:

• из исследуемой крови готовят 2-5% взвесь отмытых эритроцитов. С этой целью вносят в пробирку 5 капель (около 0,25 мл) исследуемой крови, три раза отмывают в 5-10 мл физиологического раствора; ресуспендируют осадок эритроцитов в 2-3 мл физиологического раствора или, что предпочтительнее, в 2-3 мл раствора низкой ионной силы - РНИС (в этом случае произойдет более прочная и быстрая фиксация антител на эритроцитах);
• маркируют чистую пробирку;
• вносят в нее 1 каплю реагента анти-D;
• добавляют 1 каплю 2-5% взвеси исследуемых эритроцитов;
• если эритроциты суспендированы в физиологическом растворе - инкубируют смесь при 37°С в течение 30-45 мин; если используют эритроциты в РНИС - 10-15 мин;
• отмывают эритроциты, используя 5-10 мл физиологического раствора: при использовании моноклональных анти-D-антител - однократное отмывание, а при использовании поликлональных анти-D-антител - трехкратное. Следует иметь в виду, что сыворотка крови в разведении 1:4000 инактивирует равный объем антиглобулинового реагента, следовательно недостаточное отмывание может привести к инактивации антиглобулинового реагента и ложноотрицательному результату теста;
• удаляют физиологический раствор;
• добавляют 1 каплю антиглобулинового реагента к осадку эритроцитов и тщательно перемешивают;
• центрифугируют 15-20 с при 2000-3000 об./мин (900-1000 g);
• аккуратно ресуспендируют осадок эритроцитов и визуально определяют наличие или отсутствие агглютинации. При наличии агглютинации кровь является резус-положительной. При отсутствии агглютинации - резус-отрицательной. Слабая агглютинация возможна при экспрессии антигена D^u;
• записывают результаты исследования.

Агглютинация эритроцитов, обработанных протеолитическими ферментами, IgG (неполными) анти-D-антителами

Для усиления прямой агглютинации эритроцитов в солевой среде используют предварительную обработку эритроцитов протеазами (протеолитическими ферментами): бромелином, папайном, трипсином и др. При этом повышается чувствительность метода, в том числе и в отношении слабых форм антигена D. Метод используется в системах автоматизированного определения групп крови. Особенностью этого теста, затрудняющей его применение для рутинного фенотипирования эритроцитов, является феномен прозоны - ингибирование агглютинации избыточным количеством антител. Для избежания феномена прозоны необходимо обеспечить стандартность обработки эритроцитов ферментами и строго соблюдать концентрацию анти-D-антител,- рекомендованную производителем.

Страница 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

всего страниц: 10

ЛИТЕРАТУРА [показать] .

Источник: Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, Интермедика, 2001