Коклюш относят к инфекциям с весьма длительным течением, что делает возможным применение двух основных (бактериологический, серологический) и одного вспомогательного (микроскопический) методов диагностики.

I. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД

Микроскопический метод является вспомогательным вариантом диагностики, так как коклюшные бактерии не имеют четких морфотинкториальиых особенностей.

Диагностическое значение имеет лишь 1 фаза существования коклюшных бактерий, соответствующих S - форме. В таком варианте патогенные штаммы возбудителя коклюша выделяются из организма. Это грамотрицательные, мелкие однородные, овоидной формы палочки без спор, но с нежными капсулами. При переходе во II и III фазы появляются полиморфные длинные или, наоборот, кокковидные бактерии. Для отличия названных стадий развития коклюшных палочек микроскопический метод незаменим.

II. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Выделение чистой культуры возбудителя является самым ранним и достоверным способом диагностики коклюша. Материалом для исследования служат мокрота, слизь и смывы из носоглотки больного, выделяемые цри кашле или искусственно собранные стерильными носоглоточными тампонами.

Возбудитель коклюша очень требователен к питательным средам. Поэтому для его выделения используются элективные среды: казеиново-угольный агар (КУА), Борде-Жангу и молочно-кровяной агар Осиповой.

КАЗЕИНОВО-УГОЛЬНЫЙ АГАР ИЛИ СРЕДУ КУА готовят из сухого субстрата, выпускаемого ИЭМ имени Н. Ф. Гaмалей. Перед употреблением 4-5 г сухого порошка растворяют в 100 мл дистиллированной воды, стерилизуют в автоклаве 30 минут при +110 °C и, соблюдая стерильность, разливают в чашки Петри или пробирки. Готовые среды можно хранить при +4, +10 °C до двух недель.

Колонии коклюшных бактерий на среде КУА появляются на 3-4 день. Они мелкие, выпуклые, блестящие, гладкие, серовато-кремовые. Колонии паракоклюшных бактерий такие же, но более крупные и дают коричневое окрашивание среды.

СРЕДА БОРДЕ-ЖАНГУ. 500 г мелко нарезанного очищенного картофеля заливают 1 л дистиллированной воды с 40 мл глицерина, варят до размягчения, а затем доводят дистиллированной водой до исходного объема, фильтруют через 2-3 слоя марли и дают отстояться до просветления. К 500 мл прозрачного картофельно-глицеринового экстракта добавляют 1,5 л солевого раствора, содержащего следующий комплекс солей: К₂НРО₄- 2,25 г; MgS0₄-0,075 г; КН₂Р0₄ -0,75 г; NaCl-7,5 г; КС1 -1,50 г. После этого прибавляют 60 г агар-агара (3%), кипятят на огне с асбестовой сеткой до растворения, устанавливают pH = 7,1-7,2, фильтруют и, разлив в соответствующую посуду, стерилизуют 30 минут при +110 °C или 25 минут при +120 °C. Это основа среды. Она может храниться очень долго.

Перед употреблением среду растапливают, охлаждают до 4-45 °C и добавляют 15-20% стерильной дефебринированной крови (барана, кролика, человека, лошади).

Готовая среда светло-вишневого цвета (без пузырьков воздуха). Для подавления посторонней микрофлоры добавляют 0,25-0,50 единиц пенициллина на 1 мл среды (1 ед. тормозит развитие коклюшных бактерий).

Колонии коклюшных бактерий на этой среде гладкие, блестящие, прозрачные, куполообразные с жемчужным или ртутным оттенком, окруженные зоной гемолиза. Колонии паракоклюшных бактерий крупные с коричневым окрашиванием среды и зоной гемолиза.

МОЛОЧНО-КРОВЯНОЙ АГАР ОСИПОВОЙ. 5% МПА расплавляют на водяной бане, добавляют 1% поваренной соли и смешивают с таким же количеством обезжиренного подогретого молока. Стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 40 минут. Горячую смесь отфильтровывают от свернувшегося молока, разливают по флаконам и автоклавируют при 0,5 атм. 20 минут. К остуженному до +45°, +50 °C агару добавляют 20% дефибринированной крови барана и пенициллин из того же расчета, что и в среде Борде-Жангу.

При выделении чистой культуры возбудителя следует учитывать большую требовательность к питательным средам, сравнительно медленное развитие колоний, отсутствие потемнения среды вокруг колоний, относительную биохимическую инертность, морфологическую однородность и способность агглютинироваться специфической противококлюшной сывороткой первой фазы.

При выделении чистой культуры коклюшных бактерий очень важно отдифференцировать их от часто встречающихся гемоглобинофильных бактерий паракоклюша и септического бронхита.

Антигенная дифференциация коклюшных и паракоклюшных бактерий должна проводиться с учетом общности и различий в их антигенном составе. При отсутствии необходимых монорецепторных сывороток отличием могут служить прочие, в частности культурально-биохимические признаки.

Свойство бактерий коклюша и их отличие от палочек паракоклюша
Свойства	Бактерии коклюша	Бактерии паракоклюша
Морфология	мелкие, коккобактерии	крупные палочки
Капсулы	есть, нежные	нет
Рост на простом МПА	-	+
Энергия роста	слабая, колонии видны на 3-4 день	средняя, колонии видны на 2-3 день
Образование коричневого пигмента на казеиновоугольном агаре (КУА)	-	+
Рост МПА с 0,1% тирозина	-	+
Гемолиз на кровяном МПА	+ четкий	+ слабый
Рост на пептонной воде,	-	+
с гематином	+	-
с дрожжами (экстракт)	+	-
Ферментация углеводов:
глюкозы	-	+
галактозы	-	+
левулезы	-	+
Разложение мочевины	-	+
Щелочение лакмусового молока	на 10-14 день	в первые 1-4 дня
Специфические видовые антигены	1	14
Типовые антигены	2, 3, 4, 5, 6, 13	8, 9, 10

Отношение к мочевине выясняется пробой Закса, широко используемой при дифтерии.

Основные различия между коклюшными палочками и бактериями септического бронхита приведены ниже.

Микробы	Признаки
	Рост на МПА	Наличие уреазы
Коклюшные бактерии	не растут	-
Бактерии септического бронхита	растут без изменения цвета среды	+

СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ КОКЛЮША

Начиная с 3-4 недели заболевания в крови больных начинают появляться антитела, которые можно обнаружить серологическим методом c помощью реакции агглютинации и реакции связывания комплемента по Борде-Жангу.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ. Для выполнения реакции берут кровь больного в количестве 0,8-1 мл (из пальца или пятки ребенка), помещают на 10-15 минут в термостат, а после этого - в холодильник для уплотнения и отделения сгустка. Затем проводят центрифугирование, сьшоротку отсасывают и разводят физиологическим раствором от 1:5 до 1:2500. В качестве антигена используется изготовленный производственным способом диагностикум. Схема постановки реакции следующая.

Ингредиенты	Пробирки
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
									контроль антигена	контроль сыворотки
Физ. раствор	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Сыворотка больного в разведении 1:5	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	-	0,25
Разведение	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	1:1280		1:5
Диагностикум в каплях	2	2	2	2	2	2	2	2	2	-

Пробирки с разведенной сывороткой и добавленным в них диагностикумом помещают на 2 часа в термостат при 37 °C, а затем на сутки оставляют при комнатной температуре.

Агглютинация носит мелкозернистый характер. Поэтому учет ее производят с помощью агглютиноскопа.

Реакция считается положительной при четкой агглютинации с интенсивностью на ++ + + и + + +. Диагностическим является титр 1:40. Результаты серологических реакций имеют диагностическое значение только при изучении их в динамике, в связи с чем они повторяются не менее двух раз в течение болезни с интервалами 5-7 дней.

РСК ПО БОРДЕ-ЖАНГУ. Реакцию ставят по общепринятой методике. Особенностью ее является: длительное связывание (18-24 часа на холоду при +4 °C); в качестве диагностикума берется свежеприготовленная 1 млрд. взвесь 2-дневной культуры палочек коклюша, выращенных на 20% картофельно-глицериновом агаре и смытых физиологическим раствором. Омыв бактерий центрифугируют до полного просветления, осадок эмульгируют в дистиллированной воде для растворения случайно смытых со среды эритроцитов. После повторного центрифугирования готовят 1 млрд. суспензию культуры, инактивируют при +56 °C 1 час и подвергают титрованию.

Антиген титруют в присутствии комплемента.

Схема титрования антигена коклюшных бактерий
Ингредиенты в мл	Номера пробирок и их содержимое в мл						Контроль
	1	2	3	4	5	6	антигенная гемотоксичность	комплемента
Антиген	0,05	0,1	0,12	0,15	0,2	0,25	0,25	-
Комплемент в рабочей дозе	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	-	0,25
Физиологический раствор	0,45	0,40	0,38	0,35	0,30	0,25	0,50	0,50
Встряхнуть, в термостат на 35-40 минут при +37 °C. Затем добавить гемолитическую систему.
Гемолитическая система	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Учет результатов	гемолиз	гемолиз	гемолиз	гемолиз	-	-	-	гемолиз

Титром антигена считают то его максимальное количество, при котором еще возможен гемолиз (в данном примере - 0,15 мл). Рабочая доза должна быть на 20% ниже (0,12 мл).

После этого антиген используют для постановки РСК.

Рекомендуемая литература:

1. Дяченко С. С. Микробиологические методы диагностики инфекционных заболеваний. 1962; стр. 238-244.
2. Земсков М. В., Степанов И. И. Медицинская микробиология. Пособие для студентов медицинских институтов, 1962, стр. 182-185.
3. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней, 1964, т. VI, разд. VI, стр. 349-374.
4. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных заболеваний, под ред. проф. К. И. Матвеева и М. И. Соколова, 1964, стр. 438-449, 493, 497.
5. Сборник официальных материалов по лабораторному делу. Книга первая, 1961, стр. 338-343.
6. Ашмарин И. И. Практическая медицинская микробиология, 1966, изд. "Медицина", Уз. ССР, стр. 157.

Источник: Мотавкина Н.С., Пьянова Р.Е. Микробиологическая диагностика некоторых капельных инфекций и токсоплазмоза. Методическая разработка для студентов. ВГМУ, 1973