Микробиологическая диагностика токсоплазмоза

В настоящее время для прямого или косвенного подтверждения диагноза токсоплазмоза используют паразитоскопический, паразитологический, аллергический и серологический методы, а также прямую и непрямую иммунофлуоресценцию.

ПАРАЗИТОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД

Паразитоскопические исследования различного патологического материала позволяют констатировать наличие токсоплазм в нем и ознакомиться с морфологией, тинкториальными свойствами возбудителя.

Мазки для микроскопии готовят из (предварительно отцентрифугированных в течение 15-20 минут при 2000 об/мин. жидкостей (спинномозговой, плевральной, околоплодной), крови, менструальных выделений, взвеси биопсированных кусочков лимфатических узлов или мышц, абортивной ткани, остатков плодных оболочек и плаценты.

После подсушивания на воздухе, химической фиксации (15-20 минут в смеси Никифорова; 2-3 мин. в метиловом или 15 - в этиловом 96 ° cпирте) и окраски по Романовскому-Гимза в течение 60 минут мазки просматривают с иммерсией в обычном световом микроскопе или используют для этой цели фазовоконтрастное устройство.

В случаях остро или подостро текущего токсоплазмоза иногда удается обнаружить в мазках внеклеточные формы паразита. Внешний вид eго весьма своеобразен: удлиненное, серповидное тело с округлым и заостренным концами, размером (4-7) на (2-4) микрона. Протоплазма при окраске по Романовскому-Гимза - голубая, ядро - красное.

Одновременно с единичными свободными особями - трофозоитами, встречаются и внутриклеточные скопления паразитов - псевдоцисты. Псевдоцисты - мелкие, округлые внутриклеточно расположенные токсоплазмы, окруженные тончайшей пленкой - оболочкой клетки хозяина.

В секционном материале (мозг, глаза, печень, сердце), из которого по общим правилам гистологической техники готовят препараты, можно наблюдать еще одну стадию существования токсоплазм - цисты. В последних насчитываются тысячи микроорганизмов, так близко прилегающих друг к другу, что видны лишь их ядра. Эти скопления токсоплазм округлы и имеют хорошо контурированную оболочку.

Обнаружение токсоплазм в мазках и гистологических препаратах - ценный диагностический критерий. Однако паразитоскопические исследования затруднены необходимостью дифференцировать токсоплазмы от морфологически сходных образований: Histoplasma capsulatum, Cryptococcus, Trypanosoma crusi, Leishmania, Encephalitozoon u Sarcocystis. Поэтому результаты микроскопических исследований требуют дополнительной проверки.

Для определения видовой принадлежности обнаруженных простейших можно использовать, в частности, методы прямой и непрямой иммунофлуоресценции.

Люминесцентная микроскопия токсоплазм

Специфическое взаимодействие названных простейших с антителами, конъюгированными с флуорохромом, характерное cвечение этого комплекса при изучении препарата с помощью люминесцентного микроскопа МЛ-1 или МЛ-2 позволяют обнаружить трофозоиты токсоплазм в любом материале, мазках-отпечатках, гистологических средах.

Прямой метод иммунофлуоресценции

Для выявления токсоплазм используют высушенную лиофильным способом противотоксоплазменную сыворотку кролика, к которой присоединен флуорохром - изотиоцианат флуоресцеина. Для контроля берут нормальную флуоресцирующую сыворотку кролика.

Методика обработки препаратов:

На препарат налить конъюгированную с флуорохромом противотоксоплазменную сыворотку.
Мазок во влажной камере (чашка Петри со смоченной полоской фильтровальной бумаги) поместить в термостат при температуре +37 °C на 30 минут.
Препарат промыть проточной водопроводной водой (15 минут), просушить на воздухе.
Микроскопировать в люминесцентном микроокопе.

При наличии токсоплазм в препарате видны светящиеся комплексы, образованные токсоплазмами (антигенами) и конъюгированными с флуорохромом специфическими, гомологичными антителами.

Для правильной оценки результатов опыт сопровождают следующими контролями:

Препарат с чистой культурой токсоплазм, обработанный вышеописанным способом.
Препарат, окрашенный нормальной флуоресцирующей сывороткой

Непрямой метод иммунофлуоресценции

При использовании названной методики токсоплазмы в препарате отыскивают с помощью специфических антител (иммунные гамма-глобулины кролика). Затем этот неокрашенный комплекс выявляют, обрабатывая мазок флуоресцирующей антикроличьей сывороткой.

Для работы необходимы:

Иммунная цефлуоресцирующая противотоксоплазменная кроличья сыворотка.
Флуоресцирующая антикроличья сыворотка.
Нормальная кроличья сыворотка (без флуорохрома)

Обработку препаратов проводят по следующей схеме:

На исследуемый препарат нанести неразведенную иммунную противотоксоплазменную кроличью сыворотку.
Мазок поместить во влажной камере в термостат при температуре 37°C на 30 минут.
Тщательно промыть водопроводной водой (15 мин.). Подсушить на воздухе.
Налить флуоресцирующую антикроличью сыворотку и поместить препарат при тех же условиях в термостат.
Осторожно промыть водопроводной водой (15 мин.). Подсушить. Микроскопировать в люминесцентном микроскопе.

Опыт должны сопровождать следующие контроли:

Препарат из чистой культуры токсоплазм, обработанный вышеизложенным способом.
Препарат из чистой культуры токсоплазм, к которому добавлены вначале нормальные гамма-глобулины кролика, а затем флуоресцирующая антикроличья сыворотка.

Из двух вышеописанных методик наибольшую популярность завоевала непрямая иммунофлуоресценция, т. к. с ее помощью удается обнаружить токсоплазм и даже в случаях их морфологической деструкции.

Паразитологический метод

В связи с относительно малой эффективностью и трудностями паразитоскопического исследования значительно шире используют выделение чистой культуры токсоплазм на различных биологических моделях.

Токсоплазмы - абсолютные внутриклеточные паразиты. Поэтому для их культивирования используют восприимчивых лабораторных животных (в основном белых мышей), эмбрионы птиц, культуру тканей.

Материалы исследования предварительно суспендируют в физиологическом растворе (1:3), добавляют к нему антибиотики (50 ед. пенициллина и 1000 ед. стрептомицина на 1 мл). Такие ткани, как плацента, головной мозг перед паразитологическим исследованием целесообразно предварительно обрабатывать желудочным соком. При переваривании клеток инцистированные токсоплазмы сохраняют жизнеспособность и инфективность.

ЗАРАЖЕНИЕ БЕЛЫХ МЫШЕЙ: подготовленный вышеописанным способом материал в объеме 0,2-0,3 мл вводят внутрибрюпшнно 2-3 животным. Наблюдение за последними ведут 7-10 дней. Если мыши погибают, то после их вскрытия кусочки печени, селезенки, мозга вновь эмульгируют в физиологическом растворе, добавляют антибиотики и заражают партию грызунов. Кроме этого из органов готовят мазки-отпечатки.

Иногда мыши не погибают. В этих случаях рекомендуется прибегать к "слепым" пассажам: на 10-13 день забить грызунов и суспензию из их органов ввести cледующей группе мышей. Таким способом маловирулентные и апатогенные штаммы токсоплазм удается выделить на 5-10 пассажах.

Для экономии лабораторных животных перитонеальный эксудат, полученный от инфицированных мышей, хранят в стерильных ампулах до 15 дней при +4 °C, а затем вновь инфицируют им белых мышей.

ЗАРАЖЕНИЕ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ: Использование куриных эмбрионов для паразитологических исследований весьма перспективно, ибо замкнутая стерильная полость последних обеспечивает идеальную чистоту биологической пробы. Для культивирования токсоплазм рекомендуют (Новинская В. Ф., 1965; Коновалова С. И., 1971) использовать 6-12-суточные эмбрионы.

Испытуемый материал, подготовленный вышеизложенным способом и проверенный на стерильность, в объеме 0,05-0,2 мл вводят либо на хорионаллантоисную оболочку 10-12-суточных, либо в желточный мешок 6-10-суточных куриных эмбрионов.

До начала эксперимента эмбрионы овоскопируют, определяют и отмечают простым карандашом границы распространения хорионаллантоисной оболочки у тупого конца (или воздушную камеру). Затем скорлупу обрабатывают йодом, спиртом, обжигают над огнем. Стерильным копьем делают 4-5 проколов (можно 1) в скорлупе. В каждый из них шприцем вводят по 1-2 капле испытуемого материала. Отверстия заливают расплавленным стерильным парафином.

Для заражения в желточный мешок, после овоскопии яйцо оставляют на овоскопе тупым концом вверх. В центре, над воздушной камерой, прокалывают скорлупу. Материал вводят шприцем с длинной тупой иглой, направляя ее к центру на эмбрион и слегка отодвинув последний. Отверстие заливают парафином.

Инфицированные первым или вторым способом эмбрионы в боковом положении инкубируют в термостате при + 37-38 °C, ежедневно овоскопируют, сравнивая их поведение с контрольными, незараженными особями. На 4-6 день удаляют скорлупу и разрезают хорионаллантоисную оболочку, заворачивая ее края. Шприцем отсасывают вначале аллантоисную, затем амниотическую жидкость. Далее, в стерильную посуду извлекают эмбрион, из органов и крови которого готовят препараты, мазки-отпечатки, гистологические срезы. В последнюю очередь выделяют хорионаллаитоисную оболочку.

Токсоплазмы можно обнаружить и в органах, и в периферической крови (лимфоцитах, нейтрофилах). Развитие токсоплазм сопровождается существенными изменениями и хорионаллантоисной оболочки: она покрывается серыми узелками, которые буквально нафаршированы паразитами.

Заражение культуры тканей

Удобной моделью для изучения взаимоотношений паразита и клетки хозяина является культура тканей. Обычно для этих целей используются первично трипсинизированные или перевиваемые клеточные культуры. Последние готовят по общим, принятым в вирусологии, методикам.

Перед началом опыта из пробирок удаляют питательную среду. Затем вливают 0,1-0,2 мл исследуемого, предварительно обработанного материала. Пробирки в полугоризонтальном положении помещают в термостат. После 30-60-минутного контакта жидкость удаляют, клеточный пласт промывают средой 199. Затем добавляют 1 мл питательной смеси. Каждый опыт сопровождают 5-10 контролей с незаряженной культурой ткани.

Опытные и контрольные пробирки инкубируют в термостате при +37 °C. Через сутки меняют питательную среду. Повторно эту манипуляцию проводят через 4-5 дней. Ежедневно опытные и контрольные пробирки просматривают под микроскопом (объектив х 8).

Развитие вирулентных штаммов токсоплазм сопровождается выраженным цитопатичеоким действием (ЦПД). При этом токсоплазмы обнаруживают в клеточном пласте уже на 2 сутки. Их можно найти и в культуральной жидкости. Менее вирулентные особи развиваются медленно, они выявляются на 6-7, а инцистированные паразиты на 12-14 сутки. При этом в течение всего срока жизни клеточного пласта (10-14 дней) ЦПД не наблюдается.

Резюмируя вышеизложенное, следует указать, что при абсолютной доказательности паразитологического метода нельзя не учитывать и его существенных недостатков. Это и ощутимые материальные затраты на содержание большого количества животных, и продолжительность эксперимента, и трудоемкая подготовительная работа, например, при работе с культурой клеток и, наконец, ограниченные возможности при проведении массовых обследований населения.

В этой связи понятны причины широкого использования доступных, относительно ускоренных, косвенных серологических и аллергического методов.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРЙ ТОКСОПЛАЗМОЗЕ

Реакция Сэбина-Фельдмана (РСФ)

РСФ основана на своеобразном феномене. Токсоплазмы, как отметили Сэбин и Фельдман (1948), после контакта с иммунной гомологичной сывороткой сохраняют морфологию, жизнеспособность, но не воспринимают краситель. Такое изменение тинкториальных свойств объясняют преобразованием проницаемости оболочки и структуры цитоплазмы. В это же время ядро токсоилазм сохраняет способность окрашиваться в синий цвет.

Для выполнения РСФ необходимы:

Антиген - токсоплазмы 48-72-часовой эксудат белых мышей, зараженных штаммом RH.
Активатор - неспецифический термолабильный, химически неидентифицйрованный, фактор свежей сыворотки некоторых людей. Выявление его сопряжено с исследованием серии свежих сывороток нескольких доноров с отрицательными пробами на токсоплазмоз.
В пробирку наливают 2 части цельной испытуемой неинактивированной сыворотки, 1 часть физиологического раствора и 1 часть антигена - эксудата белых мышей, зараженных токсоплазмами. Смесь выдерживают в водяной бане при +37 °C в течение 1 часа, добавляют 2 части щелочного раствора метиленовой сини. Каплю смеси помещают на предметное стекло, накрывают покровным и микроскопируют с сухим объективом х40. Сыворотку можно использовать как активатор, если 90 из 100 токооллазм окрашены метиленовой синью.
У донора, в сыворотке которого присутствует активатор, асептически берут из вены 400-500 мл крови и из нее готовят сыворотку. Последнюю разливают в термостойкие пробирки по 5-10 мл, замораживают и хранят при -30 °С 6 месяцев, проверяя ее активность перед каждым экспериментом.
Щелочной раствор метиленовой сини готовят ex fempore. Для этого берут 3 части насыщенного спиртового раствора метиленовой сини (3-4 г па 100 мл 96 ° cпирта) и 10 частей буфера с pH = 10,8-11,0 (97 мл 0,53% Na₂C0₃) и 2,7 мл 1,91 % раствора Na₂ В₄0₇).
Испытуемые сыворотки, инактивированные при +56° - 30 мин. непосредственно перед проведением опыта, разводят на физиологическом растворе последовательно четырехкратно.
Контрольная, заведомо положительная сыворотка животного с известным титром противотоюсоплазмозных антител.

В день постановки РСФ у зараженных мышей берут 1 часть эксудата и соединяют ее с 4-8 частями активатора. Концентрация токсоплазм при этом не должна превышать 10-20 паразитов в поле зрения. Суспензию встряхивают и протягивают через шприц с тонкой иглой. С помощью этой процедуры получают взвесь свободных токсоплазм. РСФ выполняют в 2-х рядах, отличающихся по характеру по следующей схеме:

Ингредиенты в мл Разведения сывороток Контроль активатора Контроль антигена

цельная 1/4 1/16 1/64 и т. д.

Сыворотка больного испытуемая (1-й ряд) 0,1 0,1 0,1 0,1 - -

Сыворотка заведомо положительная (2-й ряд) 0,1 0,1 0,1 0,1 - -

Смесь токсоплазм и активатора 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 -

Эксудат и физ. раствор - - - - - 0,3

Встряхнуть, поставить в водяную баню при 37°C на 1 час.

Метилен, синь 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Через 10-12 минут готовит препараты.

Результат - - - - 90% синих паразитов Синие паразиты

Учет результатов ведут в определенной последовательности:

В мазке из эксудата (контроль) все токсоплазмы должны быть синими и округлыми.
В препарате из смеси токсоплазм и активатора 90% паразитов округлы и окрашены.
В контроле с заведомо положительной противотоксоплазменной сывороткой 90-100% токсоплазм сохраняют присущую им морфологию, не окрашены, прозрачны, ядро имеет вид синей точки.
При анализе препаратов из проб с испытуемой сывороткой РСФ можно считать положительной в том случае, если более 50% токсоплазм осталось неокрашенными.

С помощью РСФ антитела к токсоплазмам обнаруживают через неделю после заражения. Титр их становится максимальным через 3-4 недели. Низкий уровень антител сохраняется длительно. Диагностический титр РСФ окончательно не установлен. По-видимому, следует принимать во внимание любой положительный результат, ибо даже в случаях паразитологически подтвержденного токсоплазмоза титры РСФ могут не превышать 1:4, 1:8.

РСФ специфична, чувствительна, однако не лишена существенных недостатков: отсутствие стандартных активатора, красителя, необходимость постоянно поддерживать вирулентный штамм токсоплазм, опасность работы с живыми паразитами и т. д. Все это, в известной мере, ограничивает применение РСФ и побуждает к поискам не менее надежных, но более безопасных и доступных серологических методов диагностики. Из числа последних весьма популярна реакция связывания комплемента (РСК).

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

В сыворотках инфицированных токсоплазмозом людей комплементсвязывающие антитела появляются с 8-14 дня и обнаруживаются с помощью РСК.

При постановке РСК необходимы следующие ингредиенты:

Сыворотки обследуемых лиц. Кровь в количестве 5-7 мл берут натощак у людей с нормальной температурой.
Антнген-диагностикум, изготовленный из перитонеального эксудата зараженных белых мышей, производства ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи.
Комплемент - высушенная лиофильным способом сыворотка крови морских свинок, производства Томского НИИВС.

Для индикаторной гемолитической системы нужны:

эритроциты барана, 3% взвесь;
гемолитическая сыворотка-сыворотка кроликов, иммунизированных эритроцитами барана, производства Пермского НИИВС.

Кроме того, необходимы штативы с набором пробирок; пипетки на 5,1, 2 см³; колбы (6 штук); физиологический раствор (обязательно 0,85%); центрифуга; (водяная баня, желательно с автоматической регулировкой; термостат; холодильник.

ПОДГОТОВИТЕЛЬНАЯ РАБОТА

Для проведения РСК необходимо:

Рассчитать и расставить в штативы нужную для опыта посуду. На каждую исследуемую сыворотку используют две пробирки (опыт и индивидуальный контроль).
В РСК исследуют только инактивированные сыворотки. Поэтому до постановки основного опыта разведенные 1:5 сыворотки крови обследуемых людей инактивируют при температуре + 56 °C 30 минут, (сыворотки крыс, мышей при +60 °C, кролика и собаки - при +65 °C).
Титр и рабочую дозу антигена, как правило, не определяют. Они устанавливаются при выпуске препарата и указаны на этикетке ампулы. Антиген для реакции разводят в стерильной колбе, исходя из количества исследуемых проб.
Учитывая возможное антикомплементарное действие антигена перед каждым опытом, проводят титрование комплемента в присутствии антигена по нижеследующей схеме.

Схема титрования комплемента в присутствии антигена

Ингредиенты в мл Пробирки Контроли

1 2 3 4 5 6 7 8 9 гемосистемы комплемента

Антиген 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 - -

Комплемент 1:15 0,25 0,23 0,21 0,19 0,17 0,15 0,13 0,1 0,05 - 0,25
(1:15)

Физ. раствор 0,25 0,27 0,29 0,31 0,33 0,35 0,37 0,4 0,45 0,75 0,5

Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 45 мин. при +37 °С. Затем добавляют готовую гемосистему (выдержанную в термостате 15 мин.)

Гемолитическая система 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Встряхивают. Ставят в термостат на 30 минут при +37 С.

Учет результатов гемолиз ++++
задержка гемолиза ++++
задержка гемолиза гемолиз

Титр комплемента - это то наименьшее его количество, которое еще дает полный гемолиз эритроцитов. Рабочая доза должна быть на 20% выше. В нашем примере титр - 0,1 мл. Следовательно, рабочая доза - 0,12 мл (разведение 1:15).

Количество цельного комплемента, необходимого для проведения РСК, определяют следующим образом: если исследованию подлежит 50 сывороток, в опыте будут использованы 106 пробирок (из них 4 - контроля с заведомо положительной и отрицательной сыворотками и 2 - контроли антигена на антикомплементарность и гемотоксичность.

Для создания некоторого избытка целесообразно проводить перерасчет на большее число, к примеру, на 120 пробирок. В каждую из них добавляют равные объемы всех ингредиентов реакции (0,2 или 0,25; 0,4; 0,5 - по желанию экспериментатора). Допустим, в 120 пробирок мы разлили по 0,25 мл комплемента, т е. использовали 120 x 0,25 = 30 мл раствора. Но в объеме 0,25 мл комплемент, разведенный 1:15, составляет лишь 0,12 мл (установленная рабочая доза), а цельный, неразведенный - 0,12:15. Таким образом, для 120 пробирок потребуется 0,96 мл неразведенного комплемента (0,12/ 15 x 120). Следовательно, для приготовления 30 мл раствора нужно взять 0,96 мл цельного комплемента и 29,04 мл физиологического раствора.

После завершения подготовительной работы приступают к выполнению основного опыта по следующим схемам (см. ниже).

Пробирки с основным опытом и контролями к нему встряхивают и помещают на 24 часа в холодильник (температура +4 °C). Следует заметить, что для каждой испытуемой сыворотки используют отдельную пипетку (удобнее на 1 см³). Для того, чтобы различить антиген, комплемент и физиологический раствор, берут 3 пипетки по 5 см³.

Во второй день работу начинают с подготовки гемолитической системы. При этом исходят из следующего: в каждую пробирку основного опыта нужно добавить 0,5 мл индикаторной смеси.

Таким образом, на 120 пробирок потребуется 60 мл гемолитической системы. В состав последней входят равные объемы (т. е. по 30 мл для нашего примера) гемолитической сыворотки и 3% взвеси эритроцитов.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ 3% ВЗВЕСИ начинают с отмывания эритроцитов барана. В пробирку наливают 4-5 мл бараньей дефибринированной крови и 4-5 мл физиолoгического раствора. Центрифугируют 10 минут при 1500 оборотах. С помощью дренажа надосадочную жидкость отсасывают. Вновь наливают физиологический раствор и центрифугируют, повторяя эту процедуру до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет бесцветной. На 120 пробирок нужно 30 мл 3% взвеси, целесообразнее поэтому взять 1 мл эритроцитов и 32,3 физиологического раствора.

Гемолитическую сыворотку разводят соответственно титру, указанному на этикетке ампулы, причем рабочее разведение должно быть в 3-4 раза меньше (при титре 1:1800 - 1:600).

Подготовив основные ингредиенты в отдельной посуде, составляют гемосистему. В колбу наливают 3% взвесь эритроцитов и к ним (не наоборот!) добавляют гемолитическую сыворотку (равные объемы).

Для сенсибилизации эритроцитов колбу со смесью помещают в термостат на 15 минут при +37 °C. Взвесь должна быть маслянисто-красной, без осадка.

Далее, из холодильника извлекают пробирки с основным опытом. 30 минут выдерживают их при комнатной температуре и затем добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл гемолитической системы. Энергично встряхивают. Ставят в термостат при 37 °C на 40 минут. В течение этого времени нужно следить за ходом реакции и, как только она завершится в контролях, приступать к учету результатов.

В индивидуальных контролях сывороток (внутренние ряды пробирок) должен наблюдаться полный гемолиз. В контроле с заведомо положительной сывороткой должна быть задержка гемолиза, с заведомо отрицательной - гемолиз. В контролях антигена на гемотоксичность - задержка гемолиза, на антикомплементарность - гемолиз. После этого учитывать опыт. Реакцию оценивают по степени задержки гемолиза эритроцитов и обозначают плюсами.

+ + + + полная задержка гемолиза, все эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачна.
+ + + слабый гемолиз, жидкость слегка розоватая, осадок эритроцитов значителен.
+ + значительный гемолиз (40-50% эритроцитов), жидкость интенсивно окрашена, осадок небольшой, но отчетливо виден.
+ слабая задержка, жидкость окрашена интенсивно, осадок мало заметен.
0 полный гемолиз

Схема постановки основного опыта

Ингредиенты в мл Пробирки

Опыт Индивидуальный контроль сыворотки

Испытуемая, инактивированная сыворотка, 1:5 0,25 0,25

Антиген 0,25 -

Комплемент 0,25 0,25

Физиологический раствор - 0,25

В такой же последовательности оформляются 2 контроля с заведомо положительной и отрицательном сыворотками

Ингредиенты в мл Пробирки

Опыт Индивидуальный контроль сыворотки

Заведомо положительная (или отрицательная), инактивированная сыворотка, 1:5 0,25 0,25

Антиген 0,25 -

Комплемент 0,25 0,25

Физиологический раствор - 0,25

Кроме того ставят еще 2 контроля антигена.

Ингредиенты в мл Пробирки - Контроли антигена на

гемотоксичность антикомплементарность

Антиген 0,25 0,25

Комплемент - 0,25

Физиологический раствор 0,5 0,25

Диагностическую значимость имеют (4,3 +) реакции, (2 +) РСК расценивается как сомнительный результат. В этих случаях реакцию следует повторять в динамике.

Титр антител при токсоплазмозе сравнительно невелик, поэтому во внимание принимают реакции в разведении 1:5. По ходу инфекционного процесса, в период беременности, в момент рецидива уровень антител может нарастать. В связи с этим возникает необходимость титрования положительных сывороток.

Схема титрования положительной сыворотки

Ингредиенты в мл Пробирки

1 2 3 4 5 6 7 8

(контроль сыворотки) 1:5

Физиологический раствор - 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Инактивированная сыворотка 1:5 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

(по 0,25 в 1, 2 и 8 пробирки 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320

Антиген 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 -

Комплемент 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

В термостат на 35 минут при -37°

Гемологическая система 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Результат: титр сыворотки 1:40 ++++ ++++ ++++ ++++ 0 0 0 0

РЕАКЦИЯ ПАССИВНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РПГА)

Для серодиагностики токсоплазмоза многие отечественные исследователи с успехом применяют РПГА. Реакция основана на способности токсоплазменного антигена к адсорбции на обработанных таннином эритроцитах. Такие укрупненные антигенные комплексы при встрече с гомологичным антителом сыворотки выпадают в осадок - гемагглютинат.

Для постановки реакции используют следующие высококачественные ингредиенты.

0,15 М основной раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия (26,85 г Na₂HP0₄x2H₂0 на 1000 мл бидистиллированной воды).
0,15 М основной раствор двузамещенного фосфорнокислого безводного калия (20,4 г КН₂Р0₄ на 1 л бидистиллированной воды).
0,9% физиологический раствор
Все растворы готовят на нейтральной бидистиллированной воде с pH 7,0-7,2. Для работы, в частности, необходимы:
Фосфатно-буферный физиологический раствор pH 6,4 (32,2 мл Na₂HP0₄x2H₂0; 67,7 мл КН₂Р0₄ и 100 мл 0,9% физ. раствора).
Фосфатно-буферный физиологический раствор pH 7,2 (76 мл Na₂HP0₄; 23,9 мл КН₂Р0₄ и 100 мл 0,9% физ. раствора).
Дефибринированные эритроциты барана. Перед опытом эритроциты отмывают физиологическим раствором, также, как и при постановке РСК.
Нормальная сыворотка кролика. Предварительно ее истощают цельными бараньими эритроцитами (0,5-1 мл эритроцитов на 1 мл сыворотки, 30 минут при +18 °C). Смесь центрифугируют, декантируют, готовят 1% раствор, который инактивируют при +62 °C 30 минут.
Раствор таниновой кислоты: Вначале готовят исходный 1 % раствор. Из него в день проведения опыта получают нужные большие разведения препарата. Так, для приготовления разведения 1:10 000 берут 0,1 мл 1% раствора и 9,9 мл физиологического раствора.
Испытуемые сыворотки. Последние предварительно истощают эритроцитами барана, инактивируют при +56 °C 30 минут и разводят 1:5 в 1 % растворе нормальной кроличьей сыворотки.

РПГА выполняют последовательно, придерживаясь следующей схемы:

I. ПОДГОТОВКА ЭРИТРОЦИТОВ

Берут равные объемы 3,0-3,3% взвеси эритроцитов на фосфатном буфере pH 7,2 и рабочего разведения (1:10 000, 1:20000) танина.
Смесь прогревают на водяной бане 15 минут, центрифугируют 3-5 минут (1500 оборотов).
Осадок промывают фосфатно-буферным раствором pH 7,2 путем повторного центрифугирования.
Осадок ресуспензируют в физиологическом растворе до исходной концентрации (3,0-3,3%)

II. СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ ТАНИЗИРОВАННЫХ ЭРИТРОЦИТОВ ТОКСОПЛАЗМОЗНЫМ АНТИГЕНОМ

К 1 мл танизированных эритроцитов и 1 мл антигена добавляют 4 мл фосфатно-буферного физиологического раствора pH 6,4, перемешивают, выдерживают при комнатной температуре - 15-20 минут.
Центрифугируют 3-5 минут при 1500 об/мин.
Осадок промывают 2 мл 1 % раствора кроличьей сыворотки.
Осадок ресуспензируют в 1 мл 1 % раствора сыворотки кролика.

Пробирки встряхивают, помещают в холодильник (+4°C) на 12-13 часов.

III. Постановка опыта проводится по следующей схеме

Ингредиенты РПГА в мл Опыт Контроли

№ пробирок 1 сыворотки антигенов эритроцитов

2 3 4 5

Испытуемая сыворотка, 1:5 0,5 0,5 - - -

Антиген (сенсибилизированные токсоплазменным антигеном эритроциты) 0,1 - 0,1 - -

Танизированные эритроциты (3,3%) - 0,1 - 0,1 -

3,3% взвесь эритроцитов - - - - 0,1

1% сыворотка кролика - - 0,5 0,5 0,5

Пробирки встряхивают, помещают в холодильник (+4 °C) на 12-13 часов.

Предварительный учет результатов осуществляется через 3-4 часа. Окончательный - на следующий день.

Оценку РПГА начинают с контролем в пробирках № 2, 3, 4, 5 осадок должен иметь вид диска с ровными краями. В опыте агглютинация в виде зонтика, края шероховатые, зернистые.

Эксперименту должны сопутствовать, кроме того, контроли с заведомо положительной и отрицательной сыворотками; манипуляции с ними и учет результатов аналогичны вышеизложенным.

Антитела, выявленные с помощью РПГА, появляются позднее, чем те, что обнаруживаются в РСФ, но раньше комплементсвязывающих гамма-глобулинов. В этом смысле РПГА более чувствительна по сравнению с РСК.

РПГА еще не нашла широкого применения. Это связано, очевидно, с некоторой громоздкостью методики, в частности, с необходимостью истощать сыворотки, подбирать рабочую концентрацию танина для каждой партии эритроцитов, определять экспериментально оптимальную сенсибилизирующую дозу антигена.

РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ)

Серологические пробы, рекомендованные для диагностики токсоплазмоза (особенно РСК) характеризуются высокой специфичностью, но, к сожалению, обладают довольно низкой чувствительностью. Это связано как с качеством антигенов (к примеру, со степенью их очистки), так и со стадиоспецифичностью образующихся противотоксоплазменных антител.

В этой связи понятны как попытки усовершенствовать имеющиеся диагностические препараты, так и поиски новых тестов, подтверждающих диагноз токсоплазмоза. Из числа последних наиболее перспективным является непрямой иммунофлуоресцентный метод, применяемый для индикации противотоксоплазменных антител, адсорбированных на культуре токсоплазменных паразитов.

Работу выполняют по следующей схеме:

I. Приготовление мазка антигена

К 3-дневному экссудату белых мышей, зараженных токсоплазмами, добавить 1% формалин в соотношении 1:10.
Выдержать при комнатной температуре и центрифугировать при 500 оборотах (на каждую манипуляцию 30 минут).
Осадок ресуспензировать в физиологическом растворе (концентрация взвеси 100 токсоплазм в поле зрения при микроскопии с объективом х 40).
Из взвеси токсоплазм приготовить мазки, высушить на воздухе, фиксировать либо метиловым (5 минут), либо этиловым (15 минут) спиртом.
Мазки-антигены хранят при 20 °C несколько месяцев.

II. ОСНОВНОЙ ОПЫТ

На мазок-антиген нанести одну каплю цельной или разведенной от 1:10 и далее сыворотки (качественный и количественный варианты пробы).
Поместить препарат (во влажной камере) в термостат на 15 минут.
Осторожно промыть водопроводной водой 10-15 ми нут. Высушить.
На подготовленный таким образом мазок налить 1 каплю люминесцирующей антивидовой (в данном примере - античеловеческой) сыворотки.
Во влажной камере препарат поместить в термостат на 30 минут.
Промыть водопроводной водой (15 минут), высушить на воздухе.

Препарат изучают с помощью люминесцентного микроскопа (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3 )или люминесцентной приставки (ОИ-17 ОЛС).

Опыт сопровождают следующими контролями:

Заведомо положительные и отрицательные сыворотки.
Мазки-антигены, обработанные на первом этапе, вместо иммунной, обычной нормальной сывороткой (контроль специфичности флуоресцирующей сыворотки).

Результаты РИФ оценивают по четырехбалльной системе:

4 плюса - очень яркая флуоресценция в виде зелено-желтого контрастного ореола, располагающаяся вокруг тела токсоплазм.
3 плюса - достаточно интенсивное зелено-желтое контрастное свечение той же локализации.
2 плюса - слабая без четкого разграничения флуоресценция.
1 плюс - слабое свечение по плюсам клетки.
О - отрицательная проба, когда токсоплазмы окрашены в грязно-зеленый цвет.

Диагностическую значимость имеют 4 и 3 плюсовые реакции.

Следует заметить, что иммунные гамма-глобулины, обнаруживаемые с помощью описанной выше методики, появляются раньше антител другого вида. При сравнении РСК и реакции иммунофлуоресценции (РИФ) совпадения результатов найдены в 87% случаев, при большей чувствительности РИФ.

АЛЛЕРГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Чаще всего при массовых обследованиях населения пользуются аллергической внутрикожпой пробой (ВКП).

Для выполнения аллергической внутрикожной пробы необходимо иметь: аллерген (токсоплазмин) производства Московского или Одесского институтов; шприцы на 1 мл, иглы; стерилизатор; 70 ° спирт, йод.

Перед постановкой пробы ампулу с аллергеном следует протереть спиртом, вскрыть, содержимое набрать в шприц.

Внутреннюю сторону предплечья обработать 70 ° спиртом с добавлением нескольких капель йода. Строго внутрикожно ввести 0,1 мл аллергена. На расстоянии 7 см от этого места другим шприцем ввести 0,1 мл физиологического раствора - контроль.

ВКП учитывают через 24-48 часов. В положительных случаях она сопровождается покраснением, инфильтрацией, иногда появлением пузыря.

При резко положительной реакции (++++) размеры эритемы (круглой, овальной, резко ограниченной) - 20 и и более мм в диаметре. При ВКП в +++ эритема достигает 13-20 мм, в ++ соответствует 10-12 мм. ВКП считают отрицательной, если зона покраснения не превышает 9 мм.

Через 48 часов учет повторяют. Если размеры эритемы увеличиваются (от 2-9 до 15-20 мм), пробу считают положительной.

Реакция на аллерген, как правило, бывает местной. Изредка наблюдается и общая преходящая реакция, выражающаяся в повышении температуры, слабости, головной боли.

Противопоказаниями к выполнению ВКП являются: острые лихорадочные заболевания, активный туберкулез, тяжелые аллергические состояния.

Не рекомендуется проводить ВКП у лиц старше 60 лет и детей до 2 лет, что объясняется изменением кожных покровов в старшем и иммунологической ареактивностью - в младшем возрасте.

Токсоплазмин не вызывает сдвигов реактивности организма, поэтому пробу можно повторять многократно, в динамике.

Порядок выполнения (вначале РСК, потом ВКП, или наоборот) не регламентируется. Удобнее вначале брать кровь для РСК и тут же проводить ВКП.

Как правило, исследование больных проводят одновременно с помощью серологической (чаще РСК) и аллергической проб. Результаты при этом оценивают по совокупности следующих данных: антитела к токсоплазмам появляются в среднем с 14 дня от момента заражения и сохраняются до 2, иногда до 9 лет.

Аллергия развивается с 4 недели от момента заражения и сохраняется пожизненно. Исходя из этого, если у больного ++++ РСК и отрицательная ВКП, следует думать о недавнем заражении. При этом очень важно определить титр РСК, ибо уровень антител характеризует активность инфекционного процесса.

Если ++++ РСК сочетается с положительной ВКП, можно думать о цветущей токсоплазмозной инфекции. Отрицательная РСК и положительная ВКП расцениваются как ранее перенесенная инфекция или былой контакт с инфек-том. В последнем случае РСК следует повторять, так как но ходу инфекционного процесса она может стать положительной.

Для клинической практики большее значение имеет РСК, отражающая уровень антител, динамику последних по ходу инфекционного процесса. Даже отчетливая аллергическая реакция не дает представления о концентрации антител в сыворотке, следовательно по характеру ВКП невозможно отличить активный токсоплазмоз от латентного процесса. Вот почему с помощью этой пробы не диагностируют токсоплазмоз, а просто выделяют из общей массы лиц подозрительных в отношении названной инфекции. Именно как отборочный тест ВКП совершенно незаменима при массовых обследованиях населения. Диагностическую же значимость она обретает лишь в комплексе с другими иммунологическими реакциями.

В связи с этим следует заметить, что, конечно, можно обследовать вначале с помощью ВКП, а затем лицам с положительной пробой ставить РСК. Но при этом можно пропустить свежие случаи заражения, когда положительны только РСК.

Рекомендуемая литература:

Акиншина Г. Т. Использование метода тканевых культур для диагностики токсоплазмоза и поддержания штаммов токсоплазм. В кн. "Токсоплазмоз животных", Алма-Ата, 1965, стр. 386-390.
Бакулина Н. А. Реакция непрямой гемагглютинации в динамике токсоплазмоза. В кн. "Эпидемиология и профилактика инфекционных болезней", т. 68. М., 1964, стр. 180-183.
Васина С. Г. Реакция с красителем при токсоплазмозе. Труды института зоологии АН Каз. ССР, Алма-Ата, 1963, стр. 19, 19-30.
Грачева Л. И. Внутрикожная проба. В кн. "Диагностика токсоплазмоза". М., 1966, стр. 150-159.
Галузо И. Г., Коновалова С. И. Диагностика токсоплазмоза животных. Алма-Ата, 1971.
Засухин Д. Н., Йыгисте А. К. Специфичность иммунологических реакций, применяемых в диагностике токсоплазмоза. В кн. "Диагностика токсоплазмоза", М. 1966, стр. 159-162.

Источник: Мотавкина Н.С., Пьянова Р.Е. Микробиологическая диагностика некоторых капельных инфекций и токсоплазмоза. Методическая разработка для студентов. ВГМУ, 1973