Бабиченко И.И., Ковязин В.А. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста: Учеб. пособие. – М.: РУДН, 2008. – 109 с. Экспертное заключение – доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ М.В. Самойлов Учебное пособие выполнено в рамках инновационной образовательной программы Российского университета дружбы народов, направление "Комплекс экспортоориентированных инновационных образовательных программ по приоритетным направлениям науки и технологий"	Содержание
	ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ Тема № 1. Введение. История развития метода. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции Тема № 3. Оценка результатов иммуногистохимической реакции. Положительные и негативные контроли. Возможные проблемы при проведении реакции ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ Тема № 4. Значение клеточных белков в оценке гистогенеза опухолей Тема № 5. Рецепторные белки в неизмененных и опухолевых клетках Тема № 6. Белки – маркеры клеточного цикла Тема № 7. Факторы апоптоза и пролиферации	Тема № 8. Белковые молекулы, характеризующие клеточную адгезию Тема № 9. Иммуногистохимия ангиогенеза ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ОНКОМОРФОЛОГИИ Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток. Опухоли из эпителия Тема № 11. Выявление гистогенетической принадлежности опухолей мезенхимального происхождения Тема № 12. Дифференциальная диагностика лимфом ЛИТЕРАТУРА [показать] Бабиченко И.И., Костанян И.А., Липкин В.М. HLDF – новый маркер анапластических процессов в предстательной железе человека // В кн.: Рак предстательной железы. / Под ред. Н.Е. Кушлинского, Ю.Н. Соловьева, М.Д. Трапезниковой. – М: Изд. РАМН, 2002. – С. 289-305. Георгиев Г.П. Молекулярно-генетические механизмы прогрессии опухолей // Соросовский образовательный журнал. – 2000. –Т. 6, № 11. –C. 1-7. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. – Изд. КМК, 2003. – 160 с. Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения. Российский онкологический сервер. (www.rosoncoweb.ru/library/01/02.htm). Костанян И.А., Осипова М.В., Старовойтова Е.В., Драницына С.М. Выделение и изучение механизма действия пептидно-белковых факторов дифференцировки, вырабатываемых активированными клетками HL-60 // Цитология. – 1994. – Т. 36, № 6. – С. 525. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. – 192 с. Лысенко О.Н., Ашхаб М.Х., Стрижова Н.В., Бабиченко И.И. Иммуногистохимические исследования экспрессии рецепторов к стероидным гормонам при гиперпластических процессах в эндометрии // Архив патологии. – 2004. – Т. 66, № 2. – С. 7-10. Мазуров В.И., Криволапов Ю.А. Классификация лимфом, морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 169-175. Побединский Н.М., Балтуцкая О.И., Омельяненко А.И. Стероидные рецепторы нормального эндометрия // Акушерство и гинекология. – 2000 . – №3. – С. 5-8. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы. – М.: Мир, 1987. – С. 9-22. Райхлин Н.Т., Петров С.В., Чаиркин И.Н. История иммуногистохимии // В кн. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. – Казань, 2000. – С. 12-14. Самуилов В.Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7, № 10. – С. 18-25. Семиглазов В.Ф., Нургазиев К.Ш., Арзуманов А.С. Опухоли молочной железы (лечение и профилактика). – Алматы, 2001. –345 с. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. – Волгоград: Семь ветров, 1999. – 538 с. Угрюмов М.В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии. "Итоги науки и техники" ВИНИТИ, серия "Морфология". – 1991. – вып. 15. – 115 с. Франк Г.А. Проблемы морфологической классификации и диагностики опухолей мягких тканей // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 231-236. Фролова И.И., Бабиченко И.И., Местергази Г.М. Цервикальные интраэпителиальные неоплазии и дискератозы шейки матки. – М.: Издательский дом "Династия", 2004. – 88 с. Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Эпидемиология и биология неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. –Т. 5. – C. 163-169. Coons A.H., Kaplan M.H. Localization of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. – 1950. – V.91. – P. 1-13. Coons A.H., Creech H.J., Jones R.N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1941. – V. 47. – P. 200-202. Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. Studies on antibody production. I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit // J. Exp. Med. – 1955. – V. 102. – P. 49-60. Dabbs D.J. Diagnostic Immunohistochemistry. 2-nd ed. – Elsevier, 2006. – 828 p. De Miguel M.P., Royuela M., Bethencourt F.R., Ruiz A., Fraile B., Paniagua R. Immunohistohemical comparative analysis of transforming grows factor alpha, epidermal growth factor and epidermal grows factor receptor in normal, hyperplastic and neoplastic human prostates // Cytokine. – 1999. – V.11, N9. – P. 722-727. Graham R.C., Karnovsky M.J. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 291-302. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V.27. – P. 1131-1139. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V. 27. – P. 1131-1139. Harris N.L., Stein H., Coupland S.E. et al. New approaches to lymphoma diagnosis // Hematology 2001. – V.1. –P. 194-220. Kerr J.F.R., Wyllie F.N., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics // Brit. J. Cancer. – 1972. – V. 26, № 2. – P. 239-257. Mar K.C. et al. Cell proliferation marker MCM2, but not Ki 67, is helpful for distinguishing between minimally invasive follicular carcinoma and follicular adenoma of the thyroid // Histopathology. – 2006. – V. 48, N 7. – P. 801-807. Marrack J.R. Nature of antibodies // Nature. – 1934. – V. 133. – P. 292-293. Marshall J.M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods // J. Exp. Med. – 1951. – V. 94. – P. 21–30. Moll R. Subcellular Biochemistry. Vol 31: Intermediate Filaments/ Ed. Herrmann and Harris. Plenum Press, New York, 1998. – P. 205-262. Nakane P.K., Pierce G.B.Jr. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigen // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 929. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. WHO Classification of Tumours. – 2006 . – V.5. – 427 p. Royuela M., De Miguel M.P., Bethencourt F.R., Sanchez-Chapado M., Fraile B., Paniagua R. Transforming growth factor beta 1 and its receptor types I and II. Comparison in human normal prostate, benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma // Growth Factors. – 1998. –V. 16, N 2. – P. 101-110. Sternberger L.A. The unlabelled antibody peroxidase-antiperoxidase (PAP) method. In: Sternberger, L.A., Ed Immunocytochemistry. John Wiley, New York, 1979.-p. 104-169. Thornton A.D., Ravn P., Winslet M., Chester K. Блокада ангиогенеза с помощью бевацизумаба и хирургическое лечение колоректального рака // Современная онкология. – 2007. – Т. 9, № 1. (www.consilium-medicum.com/media/onkology/07_01/49.shtml). Van Aken E., De Wever О., da Rocha A.S.C., Mareel M. Defective Ecadherin/catenin complexes in human cancer // Virchows Arch. – 2001. – V. 439. – P. 725-751. Wood G.S., Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems // J. Histochem. Cytochem. – 1981. – V. 29. – P. 1196-1204. ОПИСАНИЕ КУРСА И ПРОГРАММА

ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ

Введение

Иммуногистохимия (ИГХ) – метод выявления точной локализации клеточного или тканевого компонента (антигена) с помощью иммунологических и гистохимических реакций; при этом иммунологический анализ срезов тканей или цитологического материала проводится в условиях сохранения морфологии клеток.

В диагностической практике можно выделить несколько основных областей применения ИГХ: во-первых, при исследовании опухолей человека с целью определения гистогенеза недифференцированных опухолевых образований, отдаленных метастазов, для дифференцировки различных тканевых компонентов, составляющих комплексные опухоли; во-вторых, с целью прогностической оценки дальнейшего течения заболевания и, наконец, при назначении терапии.

Особую ценность иммуногистохимия приобретает в том случае, когда имеются трудности в определении гистогенетической принадлежности опухолевой ткани на основании изучения рутинных срезов, окрашенных гематоксилин-зозином, при этом морфологи нередко используют термин «недифференцированные опухоли». Выявление гистогенеза опухоли необходимо для решения вопроса о тактике лечения заболевания и прогностической оценке. Наибольшее клиническое применение в настоящее время ИГХ получила при классификации лейкозов и лимфом. Определенные панели антител позволяют охарактеризовать острые и хронические лейкозы, лимфогранулематоз и различные типы неходжкинских лимфом. Так, используя антитела к общему лейкоцитарному антигену, выявляют лимфомы, а антитела к белкам S-100 и HMB-45 позволяют определить меланомы.

Иммуногистохимические исследования с целью оценить органоспецифичность отдаленных метастазов проводятся с использованием набора антител, характеризующих антигенные свойства клеток различных органов: в частности, антитела к PSA выявляют рак простаты; наличие в опухолевой ткани рецепторов к эстрогенам и прогестерону позволяет сделать предположение о метастазе из молочной железы или эндометрия; антитела к тиреоглобулину выявляют опухолевые клетки фолликулярного рака щитовидной железы. Большую помощь в определении органной принадлежности метастазов оказывают антитела к различным цитокератинам.

С целью прогностической оценки заболевания, предсказания биологического поведения опухоли, появления метастазов, эффективности терапии проводят исследование пролиферативной активности (Ki-67), выраженности ангиогенеза, определение рецепторов факторов роста (продукты онкогенов her-2/neu при раке молочной железы), выявление рецепторов к стероидным гормонам, изучение степени анаплазии клеток (мутантный белок гена p53).

Несомненна роль ИГХ исследования при определении рецепторов к эстрогенам и прогестерону для назначения ряда гормональных препаратов (тамоксифен).

Таким образом, ИГХ представляет ценный современный метод диагностики, позволяющий определить гистогенез, степень пролиферативной активности и анаплазии опухолевых клеток, охарактеризовать прогноз и предложить адекватные методы лечения пациентов. Однако не следует и преувеличивать возможности данного метода при лечении конкретного пациента. ИГХ является только дополнительной методикой исследования, и ее результаты должны быть интерпретированы в контексте с другими данными обследования, включая клинические.

История развития метода

Основной принцип иммуногистохимии был предложен 70 лет назад J.R. Marrack (1934) и заключается в том, что в качестве гистохимических реагентов используют антитела, к которым присоединяют определенный флуоресцентный маркер. Авторами метода по праву считается группа исследователей под руководством A.H. Coons, которая в 1942 году впервые с помощью антител, меченных изоцианатом, выявила антигены пневмококков в инфицированных тканях (Coons A.H. et al., 1941; 1955). Затем ИГХ применяли в области эндокринологии для выявления мест синтеза различных гормонов. Однако эта методика не находила широкого применения из-за сложностей, связанных с использованием флуоресцентных микроскопов, трудностей выявления основных компонентов тканей и высокой чувствительности флуоресцентных маркеров к дегидратации.

Одним из важных открытий для дальнейшего широкого использования иммуногистохимии было выявление в 1951 году J.M. Marshall возможности локализовать in vitro молекулы адренокортикотропного гормона в гипофизе с помощью антител, меченных флуоресцентными маркерами. Локализация эндогенных антигенов in vivo была осуществлена через 4 года с помощью непрямого метода. В этих экспериментах кроличья антисыворотка против крысиного почечного антигена была введена крысам и на замороженных срезах почки крысы было выявлено наличие гамма-глобулинов с помощью меченных флуоресцентным маркером цыплячьих антител против кроличьих глобулинов.

В 1960 году для осуществления визуализации антител в электронной микроскопии было введено большое количество маркеров тяжелых металлов, таких как ферритин, коллоидное золото. Тяжелые металлы не являются идеальными маркерами для иммуногистохимии по самым различным техническим причинам, хотя сейчас применяются оригинальные методики с использованием коллоидного золота.

Методы использования конъюгированных ферментами антител были независимо разработаны P.K. Nakane, G.B. Pierce (1966) и S. Avrameas, J. Uriel (1966). Наибольшую популярность получил пероксидазно-антипероксидазный метод L.A. Sternberger с соавт. (1977). Для визуализации энзиматических маркеров в конце реакции антиген-антитело проводят гистохимическую реакцию, в результате которой фермент становится видимым на световом уровне. Дальнейшее усовершенствование этой реакции привело к тому, что продукты реакции были видны и на электронно-микроскопическом уровне, за счет взаимодействия с осмием они становились электронно-плотными.

В последние годы применение иммуногистохимии в морфологии широко развивалось в связи с разработкой новых методов конъюгации антител, фиксации тканей, демаскирования антигенов, а также использования новых ламп и фильтров для флуоресцентной микроскопии.

Основные фундаментальные знания в области иммунохимии

В основе любой иммунологической реакции лежит взаимодействие антигена с антителом, которое приводит к формированию комплекса «антиген-антитело».

Антигены – чужеродные вещества сложной органической природы, способные при попадании в организм вызывать иммунные реакции. Небольшой участок антигена, с которым будет связываться антитело, называется эпитопом.

Различают полные и неполные антигены. Полные антигены – это белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, синтетические высокополимерные соединения, вирусы, паразиты, бактерии. Неполные антигены, или гаптены, – низкомолекулярные соединения, которые сами по себе не могут вызывать иммунного ответа, однако, соединяясь с клетками и тканями организма, в комплексе становятся полными антигенами, способными вызывать иммунный ответ.

Антитела – вещества белковой природы, которые образуются в организме в ответ на антигены и, специфически взаимодействуя с ними, уничтожают их, обеспечивая гуморальный иммунитет. Антитела обладают специфичностью к антигенам, т.е. связываются только с тем антигеном, на который вырабатывались.

Антитела принадлежат к группе белков иммуноглобулинов – близкие по химическому строению и свойствам глобулярные белки, которые обладают способностью соединяться с антигенами. Антигены, попадая в организм, способствуют образованию антител. У человека и высших позвоночных известно 5 классов иммуноглобулинов (IgA, IgD, IgE, IgG и IgM). Молекулы иммуноглобулинов (Ig) построены из легких и тяжелых полипептидных цепей, расположенных симметрично (L- и H-цепи). Легкие и тяжелые цепи состоят из двух областей – вариабельной и постоянной. Вариабельные участки принимают участие в контакте с антигеном, это определяет специфичность антител. Антитела чувствительны к протеолитическим ферментам и распадаются на два идентичных Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент. Fab-фрагменты сохраняют свою способность связываться с антигеном. Fc-фрагмент не способен связываться с антигеном, он определяет специфичность связывания молекулы Ig с клетками-эффекторами, несущими на своей поверхности рецепторы Fc-фрагмента; именно к этой части антитела можно присоединить различные вещества; в частности для проведения иммуногистохимических реакций к данному фрагменту присоединяют биотин, флуорохромы или ферменты.

Структурное разнообразие антител определяется последовательностью аминокислот в вариабельных областях тяжелых и легких цепей. Постоянные области иммуноглобулинов кодируются одним геном для каждого класса антител. И антитела, и антигены могут быть поливалентными (т.е. иметь множество участков связывания) в результате повторения эпитопов и в результате наличия многих эпитопов, с которыми будут связываться разные антитела.

Антитела, которые используются в иммунологических методиках, получают путем повторной иммунизации различных животных (чаще мышей, кроликов, крыс, овец, лошадей и др.) определенным антигеном. После выработки антител у иммунизированного животного берут сыворотку крови и очищают ее от других сывороточных протеинов.

Поскольку большие молекулы могут иметь несколько эпитопов, они стимулируют множество линий В-клеток, которые синтезируют несколько видов антител к разным эпитопам одного и того же антигена. Получаемые антитела называют «поликлональными», они являются смесью антител к различным эпитопам антигена.

Моноклональные антитела представляют собой продукт одного клеточного клона плазматических клеток, таким образом все антитела являются иммунологически идентичными и реагируют с одним эпитопом антигена, к которому они были получены. Получение моноклональных антител включает в себя следующие этапы: иммунизация животных; подготовка В-лимфоцитов селезенки к слиянию; слияние с клетками миеломы; отбор индуцирующих специфические антитела клонов; клонирование и наработка гибридомных клеток; получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела; выделение антител.

Важнейшим этапом любого иммуногистохимического метода является визуализация результатов реакции «антиген – антитело». Антитела обладают свойством прочно связываться с тканевыми антигенами, при этом не связанные антитела можно удалить отмыванием срезов. Поскольку окрашенные продукты реакции являются нерастворимыми, они оседают в месте взаимодействия антител. Для выявления образовавшегося в процессе реакции комплекса «антиген – антитело», используют различные метки, связанные с Fc-фрагментом антител: ферменты, флуорохромы, биотин, металлы.

В настоящее время в качестве окрашенных меток широко используются пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза. Окисление пероксидазы хрена с помощью 3-диаминобензидина тетрахлорида придает продуктам реакции коричневую окраску, в то время как щелочная фосфатаза после взаимодействия с различными субстратами (AS-MX фосфат, 5-бром-4-хлоро-3-индоксил фосфат и др.) формирует нерастворимые продукты, которые в зависимости от используемого красителя можно окрасить в синий (прочный синий ВВ) или красный (прочный красный TR) цвет.

Подобным образом осуществляется визуализация первоначально не видимых тканевых и клеточных антигенов с помощью иммуногистохимической методики.